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研究目的： 食管癌一直是威胁中国居民健康的主要恶性肿瘤之一，河南省更是食管癌的高发地区。近年来，虽然食管癌的发病率和死亡率有所下降，但中国食管癌死亡率仍居世界首位。中国食管癌有其自身特点，病理类型以鳞状细胞癌为主，占食管癌所有类型的90％以上。食管癌起病隐匿，早期症状一般不明显，症状一旦出现时多为中晚期，无法手术，只能采取放、化疗结合等综合治疗手段，患者生存率很差。食管癌的确切发病原因尚不清楚，可供选择的治疗方式有限，只有深入探讨其发病机制，寻找新的治疗靶点，才能有效提高患者的预后。 近年来，研究普遍认为癌症与炎症之间存在潜在关联，但具体关系有待进一步阐释。PTX3属正五聚蛋白家族成员，是一种典型的急性期蛋白，由造血细胞和基质细胞响应于初级促炎性刺激而表达，是先天免疫中体液免疫必不可少的成分之一，参与对病原体的识别、炎症的调节和组织重塑。研究证明，PTX3在肿瘤进展中发挥着重要作用，包括肿瘤发生、血管生成、转移扩散和肿瘤免疫调节等。但PTX3在食管癌尤其是食管鳞癌中的研究鲜有报道，其在食管鳞癌中的具体作用及其相关机制有待进一步探索。 首先对PTX3在癌症中的表达预后做了系统评价和荟萃分析（即Meta分析），了解PTX3表达与癌症患者的总生存期(OS)和无病生存期(DFS)的关系。然后用IHC染色方法检测了食管鳞癌组织中PTX3蛋白的表达情况，分析PTX3的表达与患者临床病理学参数和预后的相关关系;随后，对PTX3基因在食管鳞癌细胞中的作用做了深入的研究，利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术和pCDH-CMV-PTX3-EF1-copGFP慢病毒载体分别获得PTX3基因敲除和过表达的食管鳞癌KYSE450细胞系，探索PTX3基因对食管鳞癌细胞生物学特性及功能的影响和相关机制;最后，进行裸鼠成瘤实验，在体内验证PTX3基因的作用及其相关机制。 第一部分:PTX3在食管鳞癌组织中的表达与临床病理参数及预后相关性分析 研究方法： 1.通过检索MEDLINE、EMBASE、Cochrane CENTRAL以及Web of Science等数据库，对PTX3在癌症中的表达预后做Meta分析。 2.利用免疫组织化学(IHC)方法，检测294例食管鳞癌组织标本中PTX3蛋白的表达，分析PTX3的表达与患者临床病理学参数和OS之间的关系。 3.应用SPSS22.0软件进行统计学分析。利用Chi-square或Fisher's精确检验方法分析PTX3蛋白表达和临床变量间的相关关系;患者生存期采用Kaplan-Meier方法评价，组间差异利用log-rank检验进行比较;COX回归方法检测各指标对预后的影响。 研究结果： 1.PTX3表达与癌症患者的OS和DFS显著相关。因此，有必要进行前瞻性研究，以验证癌组织PTX3表达与患者预后之间的关系。 2.294例食管鳞癌组织标本中，一年内死亡的患者123/155(79.35％)PTX3蛋白呈阳性表达，生存期五年以上的患者74/139(53.24％)PTX3蛋白呈阳性表达。PTX3蛋白的表达与生存期（P=0.000）呈负相关性，与TNM分期(P=0.020)和临床分期(P=0.003)呈正相关性。PTX3表达与患者OS呈负相关。 3.多变量检验分析结果表明，在食管鳞癌组织标本中，PTX3表达、年龄、肿瘤大小、TNM分期和淋巴结转移可以独立作为食管鳞癌患者总生存率的预测因子。 第二部分:PTX3基因敲除和过表达食管鳞癌细胞系的构建及功能分析 研究方法： 1.利用荧光定量PCR(RT-PCR)和蛋白免疫印迹方法(Western Blot)，验证食管永生化细胞系和食管鳞癌不同细胞系中PTX3的表达情况; 2.利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对食管鳞癌细胞系KYSE450进行PTX3基因敲除，挑选单克隆，建立稳定的PTX3基因敲除细胞系;同时，利用pCDH-CMV-PTX3-EF1-copGFP慢病毒载体体外建立PTX3过表达的KYSE450细胞系。 3.利用长时间活细胞动态成像系统(Incucyte ZOOM)和平板克隆实验检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞周期和凋亡，Transwell实验和划痕实验了解细胞迁移能力，利用Incucyte ZOOM和克隆形成实验了解细胞化疗和放疗敏感性，应用Seahorse XFe96检测细胞能量代谢情况，分析PTX3基因敲除后食管鳞癌细胞糖酵解和氧化磷酸化代谢模式的变化;流式检测细胞内活性氧(ROS)含量;血管形成实验模拟细胞血管生成情况;成球实验观察细胞自我更新能力。 4.研究结果： 1.不同细胞系中PTX3基因和蛋白表达检测结果显示，KYSE450细胞系中PTX3表达量最高，食管鳞癌细胞系（KYSE140，EC109和KYSE450）较永生化食管黏膜上皮细胞系Het1A中PTX3的表达量均增高。 2.成功构建了PTX3基因稳定敲除的KYSE450细胞系模型，命名为KYSE450PTX3-/-细胞;获得了PTX3基因过表达的稳定细胞系，即KYSE450PTX3-OV。 3.PTX3基因敲除后，KYSE450细胞增殖减缓，周期抑制，凋亡增加，迁移能力减弱，细胞化/放疗敏感性更高，糖酵解代谢降低，氧化磷酸化增强，ROS产量降低，自我更新能力和血管生成能力减弱。反之，PTX3过表达细胞促进细胞增殖，加快细胞周期，减少凋亡，增强迁移能力，化/放疗敏感性降低。 第三部分:PTX3在食管鳞癌中的作用机制研究 研究方法： 1.预测PTX3上游调控位点，进行染色质免疫沉淀实验(CHIP)和凝胶迁移实验(EMSA)验证SOX9是否直接调控PTX3转录表达。 2.细胞瞬时转染SOX9，使SOX9表达降低，观察SOX9沉默后细胞增殖、周期、凋亡的变化。 3.IHC法检测人食管鳞癌组织中SOX9的表达情况，与PTX3表达做关联分析;免疫荧光法检测食管鳞癌组织中SOX9和PTX3的共定位表达。 4.对KYSE450和KYSE450PTX3-/-细胞进行转录组测序，检测差异基因表达及差异基因相关GO和KEGG通路变化情况。 研究结果： 1.CHIP和EMSA实验证明，SOX9位于PTX3上游的启动子区，直接调控PTX3的转录表达。 2.SOX9沉默引起PTX3表达下降，使细胞增殖减慢、周期抑制、凋亡增加。 3.IHC检测发现，SOX9和PTX3表达呈正相关，表达SOX9高的组织，PTX3表达也高，反之亦然;免疫荧光检测结果表明食管鳞癌患者样本中SOX9和PTX3之间共定位表达呈正相关。所有这些结果提示SOX9和PTX3在食管鳞癌中存在正相关。 4.测序检测分析提示KYSE450PTX3-/-细胞的人类白细胞抗原(HLA)系统相关基因出现明显上调，RT-PCR验证结果与转录组测序结果一致。HLA系统相关蛋白在食管鳞癌组织中染色结果证明HLA ClassⅠABC，HLADR+DP+DQ和CD74的表达均与食管癌患者的生存时间存在关系，且呈现显著正相关。 第四部分:PTX3对体内成瘤能力的影响及相关机制研究 研究方法： 1裸鼠成瘤实验观察细胞体内成瘤能力的变化，及对多西他赛的敏感性。 2IHC法检测裸鼠肿瘤组织内PTX3和HLA系统相关蛋白的表达情况。 研究结果： 1.KYSE450PTX3-/-细胞在体内生长缓慢，形成的肿瘤体积较小，对多西他赛敏感;反之，KYSE450PTX3-OV细胞体内成瘤生长较对照组快，对多西他赛不敏感。 2.裸鼠组织内KYSE450PTX3-/-组PTX3表达明显下调，仅有少量细胞弱阳性表达，KYSE450PTX3-/-给药组，PTX3表达基本阴性。KYSE450PTX3-/-组HLA ClassⅠABC，HLA DR+DP+DQ和CD74的表达均明显高于KYSE450对照组。 研究结论： 1.PTX3表达与癌症患者的OS和DFS显著相关。因此，有必要进行前瞻性研究，以验证癌组织PTX3表达与患者预后之间的关系。人食管鳞癌组织中，PTX3蛋白的表达与生存期呈负相关性，与TNM分期和临床分期呈正相关性，PTX3高表达与患者OS较短显著相关，说明PTX3在食管鳞癌的发生发展过程中起着重要作用。 2.PTX3影响细胞增殖、周期、凋亡、迁移能力及化/放疗的敏感性，KYSE450PTX3-/-细胞糖酵解降低、氧化磷酸化增强、ROS产量降低、自我更新能力和血管生成能力减弱，提示PTX3可作为食管鳞癌评价恶性程度的因子和潜在治疗靶点。 3.食管鳞癌组织中SOX9与PTX3表达呈正相关，SOX9直接调控PTX3的表达，PTX3敲除后，HLA系统相关基因明显上调，说明PTX3在食管鳞癌中的作用可能是由于被SOX9调控，进而影响HLA系统来实现的。 4.PTX3影响细胞体内成瘤能力和对多西他赛的敏感性，KYSE450PTX3-/-组体内HLA ClassⅠABC，HLA DR+DP+DQ和CD74表达均高，验证了体外实验的结果，进一步阐释了PTX3在食管鳞癌中的作用。