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已有研究表明，花生蛋白具有一定的药用价值，但对其中的2s蛋白的药用价值研究较少。本论文着重研究花生2s-4b基因的克隆、原核表达及其融合蛋白抑制肺腺癌A549细胞增殖及诱导细胞凋亡的作用，为以后进一步深入研究其抑癌机制提供实验和理论依据。
以发育中后期的花生（Arachis hypogaea L.）种子为材料，根据本实验室得到的花生2s蛋白双向电泳及2s-4b的MS质谱分析结果，设计简并引物，利用RT-PCR方法进行梯度PCR扩增；根据得到的测序结果，采用RACE的方法克隆出2s-4b基因。运用生物信息学手段对2s-4b编码蛋白的结构特点、性质与功能进行分析和预测，得知其开放阅读框（ORF）共含519 bp，包括起始密码子ATG和终止密码子TAA，编码172个氨基酸，分子量为20.1 kDa，等电点为5.96。2s-4b编码蛋白的N端含有一个长约20个氨基酸的信号肽，具有AAI结构域；其二级结构主要由α-螺旋组成。
根据2s-4b基因的ORF序列和原核表达载体pET-32a的酶切位点设计了两条分别含有Nco Ⅰ和Not Ⅰ酶切位点的引物，以反转录产物为模板进行PCR扩增。PCR产物和载体质粒经双酶切、纯化后，利用T4连接酶进行连接并转入大肠杆菌Rosetta-gami B中。转化子经抗性筛选、PCR鉴定、双酶切鉴定和测序，证明2s-4b基因原核表达载体pET-32a-2s-4b构建成功。从诱导温度和IPTG终浓度这两方面优化重组蛋白的表达体系，SDS-PAGE电泳检测结果显示该重组蛋白以包涵体的形式存在。在28℃下用终浓度为0.5 mM的IPTG诱导培养过夜，得到大小约40 kDa的融合蛋白，其表达量占菌体体积的58％。
原核表达产物的纯化采用溶菌酶和8 M尿素相结合，达到破碎细菌、包涵体变性溶解的目的，利用His·tag亲和纯化得到的目的蛋白纯度达75％以上。通过尿素梯度浓度透析复性，得到具有620 U/mg胰蛋白酶抑制活性的融合蛋白，明胶SDS-PAGE染色结果表明经胰蛋白酶消化5 h后，2 s-4b有一条抑制带出现，确定2s-4b融合蛋白具有胰蛋白酶抑制活性。
通过MTT法检测不同浓度2s-4b融合蛋白体外抑制A549细胞的生长，结果显示2s-4b融合蛋白对A549细胞的抑制作用呈现剂量依赖关系，在200μg/ml 2s-4b融合蛋白作用24 h后，A549细胞生长抑制率可以达到64％以上，IC50为175μg/ml。利用倒置显微镜和HE染色观察，我们发现2s-4b融合蛋白能抑制肺腺癌细胞的生长，促进细胞凋亡，并呈现显著的量效、时效依赖关系。