小麦Ta14-3-3A基因功能的初步分析

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14-3-3蛋白是一类酸性的、高度保守的广泛存在于真核生物中的调节蛋白,其在代谢、信号转导、转录、胁迫抵御及生长发育等调控过程中都具有重要作用。因此,14-3-3蛋白受到广泛关注并已有多方面的研究,但在小麦中还研究的不够。本研究在实验室前期克隆工作的基础上,对小麦中的一个14-3-3蛋白基因(命名为Ta14-3-3A)进行了功能鉴定,主要研究结果如下:  生物信息学分析Ta14-3-3A蛋白,结果表明Ta14-3-3A蛋白为酸性、亲水的、不稳定蛋白;分子量为29.29kDa;二级结构α螺旋占比比较高;可能具有转录功能;亚细胞定位在胞质,是一种非跨膜蛋白;三维结构呈凹槽结构;氨基酸同源性比对显示其与近缘物种具有相同的保守域,在两端区域氨基酸序列差异较大;进化树中其与亲缘关系较近的Ta14R2、Hv14A、OsGF14a等蛋白聚在同一枝,且与烟草14h-1蛋白同源性较高。  对小麦接种叶锈病菌,发现Ta14-3-3A基因在接菌12h后表达量有上调,72h后表达量开始下降;盐旱处理1h后Ta14-3-3A基因的表达量有增加趋势,说明Ta14-3-3A基因可能在应对生物胁迫、盐胁迫和旱胁迫中有一定作用。  构建Ta14-3-3A基因的正反义植物表达载体,将获得的转正反义及空载体植株分别命名T#、R#、P#株系。由烟草14h-1蛋白与Ta14-3-3A亲缘关系较近,且14h-1与胁迫响应有一定的关系。设计14h-1基因的特异引物RT-PCR检测得知插入的Ta14-3-3A基因对14h-1的影响不明显。对T1代幼苗、叶片分别进行盐、旱、病害处理,结果显示T#、R#株系对盐胁迫表现出一定抗性,旱胁迫下幼苗根长有增长但在统计中差异不显著。接种黑胫病后转基因株系病斑扩散速度大于对照,T#株系病斑大小大于R#株系,青枯病侵染后转基因株系单位叶面积菌落数大于对照,且在统计中T#株系菌落数显著性增加。T#株系在表型上包括结实率较对照差异不明显;R#株系开花时株高降低、结实率降低,其他表型差异不明显。  对木质素分析,Wiesner染色和Maule染色显示转基因株系木质素含量与组成较对照变化不明显。在病原侵染后Wiesner染色变深,Maule染色变化不明显。RT-PCR检测相关木质素合成关键酶基因表达情况,在转基因植株中变化不明显,在病原侵染后相关木质素内源基因较侵染前具有上调趋势。  综上所述,Ta14-3-3A过表达对烟草内源基因和木质素关键酶基因及代谢影响不明显,但可增加烟草抗盐性、病害敏感性。Ta14-3-3A能反义抑制烟草内源14-3-3基因的表达、影响株高,同时增加植株耐盐性和对病害的敏感性。
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