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类芽孢杆菌CH-3（Paenibacillus sp. CH-3）是本实验室从刺槐种子中筛选分离到的一株植物内生菌，具有较强的β-甘露聚糖酶活性，采用简并PCR和TAIL-PCR（thermalasymmetric interlaced PCR）技术从该菌基因组DNA中克隆得到β-甘露聚糖酶基因（manA）。序列分析表明，该基因开放阅读框（ORF）为984bp，编码一个含有327个氨基酸、等电点为7.01、理论分子量约为35.270KDa的蛋白，N端前32个氨基酸为其信号肽。同源性分析显示，该酶氨基酸序列与来源于Paenibacillus sp.A1MANA1的氨基酸序列同源性高达81.35%，属于糖苷水解酶5家族（GH5）的一员。通过对该酶分子三维结构的预测分析，该酶的二级结构由14个α螺旋和15个β折叠股构成，其催化域采用一定的折叠方式形成TIM桶状结构。根据表达载体pET32a（+）或pET28a（+）的多克隆位点及目的基因序列特点，选择BamH I和Sal I酶切位点处作为目的基因的插入位置，构建重组表达质粒pET-manA，并将其转入大肠杆菌表达系统BL21（DE3），经过诱导获得了此酶的高效表达。对重组β-甘露聚糖酶酶活力进行初步检测，结果显示，酶活力可达90.34U/ml。表达产物经SDS-PAGE凝胶电泳分析，蛋白图谱显示1条大约为50.4KDa（pET28a表达系为39.4KDa）的特异性条带。实验探讨了温度、诱导物（IPTG）浓度和诱导时间三种单因素对重组β-甘露聚糖酶基因工程菌产酶的影响，并在此基础上设计了正交组合试验，结果显示，该菌摇瓶发酵的最佳条件组合为：发酵温度28℃，IPTG0.05mM，诱导时间12h，且在此发酵条件下，酶活力可达1054.17U/mL，比初始酶活提高了约10.7倍。各因素对该菌产酶的影响大小依次为诱导物（IPTG）浓度>诱导时间>互作项（温度×IPTG浓度）>温度。50L发酵罐中进行该菌扩大培养试验，结果表明，在添加诱导物（IPTG）2h后，β-甘露聚糖酶的活力就已达到较高水平，诱导8h后，酶活力达到最高，为1917.96U/ml，比初始酶活力提高了约20.2倍。之后酶活力略有下降，但总体上来看保持稳定。酶学性质研究表明，该菌所产的重组β-甘露聚糖酶最适作用温度和pH分别为45℃和7.0。该酶在3545℃范围内酶活力比较稳定，50℃条件下保温30min后，酶活仍保留74.23%，55℃保温30min后酶活基本丧失；pH4.07.0条件下保温15min酶活均保留87.06%以上；Ca2+、Ba2+、Mg2+、Mn2+、Co2+对该酶具有激活作用，其中以Ca2+的激活作用最为明显，可使酶活力提高约61%；Cu2+、 Zn2+、 EDTA和Fe2+对其具有抑制作用。枯草芽孢杆菌HD-1（Bacillus subtilis HD-1）是本实验室从黄豆种子中筛选分离到的另一株植物内生菌，同样具有较强的β-甘露聚糖酶活性，利用PCR技术从该菌基因组DNA中克隆得到β-甘露聚糖酶基因（manB），序列分析表明,该基因全长1089bp, N端前27个氨基酸为其信号肽。该酶氨基酸序列与相同来源的β-甘露糖苷酶同源性最高达98.34%，具有ManB保守结构域，属于糖苷水解酶家族26的一员。通过对该酶分子三维结构的预测分析，该酶的催化域形成TIM桶状结构，Cys92和Cys112形成二硫键，它们之间的部分构成该酶的氧化还原反应的活性中心。三维结构的分析为提高酶的催化活性和功能方面的定向改造提供了依据。