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1目的
探讨补肾固表方对氢化可的松琥珀酸钠诱导免疫低下(肾阳虚)小鼠行为学、肺TLR4、/NF-κB信号通路和血浆CD4+CD25+foxp3+Treg的影响及其量效关系,进一步探讨补肾固表方对小儿反复呼吸道感染天然免疫和获得性免疫的调节机制。
2方法
利用氢化可的松琥珀酸钠连续腹腔注射BALB/c小鼠14天,诱导免疫低下(肾阳虚)模型,模拟反复呼吸道感染体质。随机分补肾固表方(BGR)大、小剂量组、核酪组、模型组,分别灌胃BGR大、小浓度煎剂、核酪口服液和蒸馏水,正常组灌胃蒸馏水。4周后评价小鼠行为,观察肺组织病理,免疫组化SABC法和Westernblot法检测肺组织TLR4和NF-κB(p65)表达,荧光定量PCR检测肺TLR4mRNA表达,流式细胞术检测血CD4+CD25+foxp3+Treg细胞含量。
3结果
3.1建立反复呼吸道感染(肾阳虚)模型小鼠
小鼠反应迟钝、皮毛乏光、活动少、扎堆明显、食量下降、体重增加缓慢、阴囊皱缩等,符合肾阳虚标准,作为反复呼吸道感染模型。经BGR大、小剂量组和核酪灌胃4周后,各组小鼠皮毛转光泽、活动增多、扎堆减少、食量和体重增加,肾阳虚症状改善。
3.2补肾固表方对反复呼吸道感染(肾阳虚)模型小鼠TLR4/NF-κB(p65)信号通路影响
正常组支气管上皮和肺泡间隔细胞胞浆TLR4轻度表达,模型组表达明显下降(P＜0.05),BGR大剂量组表达增加(P＜0.05),小剂量组、核酪组未见明显变化(P＞0.05):Westem blot结果与免疫组化结果一致。模型组TLR4 mRNA明显减少(P＜0.05);BGR大、小剂量组表达增加(P＜0.05)。正常组肺泡上皮细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞胞浆和胞核均有少量NF-κB(p65)表达,模型组胞核内表达明显下降,低于正常组(P＜0.05),BGR大剂量组核内表达量增加,与模型组比较有差异(P＜0.05),大、小剂量组间未见差异,核酪组未见增强。Western blot结果与免疫组化结果一致。
3.3补肾固表方对反复呼吸道感染(肾阳虚)模型小鼠血CD4+CD25+foxp3+Treg影响
造模后CD4+CD25+foxp3+Treg明显上升至(9.55±1.32)％,与正常组有显著性差异(P＜0.05),BGR组含量下降(6.18±1.09)％,(P＜0.05);核酪口服液含量下降(6.32±1.13)％,与模型组比较均差异显著(P＜0.05)。
4结论
4.1利用氢化可的松琥珀酸钠建立免疫低下小鼠模型,肺组织天然免疫受体TLR4表达下降,CD4+CD25+foxp3+Treg抑制活性增强,符合小儿反复呼吸道感染肾阳虚证和免疫学变化特征,为客观评价补肾固表方疗效和药理机制奠定扎实的实验基础。
4.2补肾固表方增强肾阳虚小鼠肺组织TLR4表达,提高小鼠气道天然免疫功能;增强肺组织NF-κB(p65)的表达,增强气道对病原体的炎症反应能力。
4.3补肾固表方降低肾阳虚小鼠CD4+CD25+foxp3+Treg水平,减轻免疫抑制活性,影响Th1/Th2平衡,抑制Th2优势介导的呼吸道炎症反应,有利于激活Th1型免疫反应,降低病情程度。
4.4从中医理论和现代免疫学角度分析,推测“正邪相争”与“免疫反应”,“肾藏精-精生髓-髓生免疫”,“补肾”与“调节免疫”,“卫气”与“天然免疫”,“肺主肃降”与‘TLR/NF-κB信号通路,“和解少阳”与调节性T细胞之间有着某种内在联系,创新了中医药理论。