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为制备相应的特异性抗体用于快速分离鉴定A/B亚群的ALV,本实验分别克隆表达了A亚群禽白血病病毒(ALV-A) SDAU09C1株和B亚群禽白血病病毒(ALV-B) SDAU09C2株的囊膜gp85基因,尝试应用gp85基因的表达产物免疫家兔来获取大量高效价的特异抗血清。根据已发表A亚群禽白血病病毒(ALV-A) SDAU09C1株和B亚群禽白血病病毒(ALV-B) SDAU09C2株基因序列,利用primer5.0设计并合成一对引物。利用PCR方法扩增两毒株的囊膜gp85基因片段,将目的片段克隆至pMD18-T载体并转化感受态细胞BL21(DH5a),构建重组载体。经核酸序列测定,克隆的基因片段分别长1017bp,1038bp,为gp85基因开放性读码框的全长序列,分别编码339,346个氨基酸。将gp85基因片段分别连接至pET-32a(+)表达载体中,经抗性筛选、PCR扩增、限制性内切酶分析,筛选获得目的片段正向插入、有正确读码框的阳性克隆,分别命名为pET-SDAU09Cl-gp85和pET-SDAU09C2-gp85。阳性克隆质粒转入E coli.BL21(Rosetta)宿主菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳表明重组蛋白以包涵体的形式出现。通过诱导表达条件的优化,确立了最佳的诱导条件为30℃,1mM IPTG浓度,诱导表达5h。因融合蛋白氨基端含有6个组氨酸,用镍金属亲和层析纯化目的蛋白。取A亚群禽白血病病毒(ALV-A) SDAU09C1株和B亚群禽白血病病毒(ALV-B) SDAU09C2株的阳性鸡血清分别进行Western blotting检测,结果显示表达的重组蛋白是特异性的。将纯化的融合蛋白按常规方法免疫家兔,三免后一周,心脏采血分离血清。取两种抗血清进行间接免疫荧光反应(IFA)测定效价,效价均可达1：500,其中SDAU09C1抗血清在1：100稀释时效果较好,而SDAU09C2抗血清在1：50稀释时效果较好。取抗血清最佳稀释度与本实验室保存的A亚群禽白血病病毒SDAU09E1株,SDAU09C3株,和J亚群禽白血病病毒HN0001株进行IFA区分鉴定。结果不论是A亚群SDAU09C1血清还是B亚群SDAU09C2血清都能与A或B亚群的不同毒株发生阳性反应,但效价不同。然而,二种血清都不与J亚群的(?)(?)X0101株发生反应。用制备的两种抗血清,采用固定病毒(200TCID50)稀释血清的方法进行交叉中和反应。结果显示,抗SDAU09C1株gp85产生的兔血清的抗体效价比较高,对两个分离株都有较高的中和效价。而且对SDAU09C2株的中和效价甚至高于SDAU09C2株抗血清对自身病毒的中和值,但每一种血清对自身病毒的中和值都明显高于对异源病毒的中和值。为此,本实验计算和分析了二株病毒间抗原性相关系数r值,结果显示SDAU09C1株与SDAU09C2株在病毒交叉中和反应中的r值为36.6%。