论文部分内容阅读
蜂毒素(Melittin)是欧洲蜜蜂(Apis mellifera)蜂毒中的一种小分子多肽，具有抗菌、消炎、抗辐射、抗肿瘤、抗艾滋病毒及治疗各种炎症的作用，但蜂毒素同时还有溶血的副作用，极大地限制了其在医药领域的应用。因此，降低或消除蜂毒素的溶血作用，保留甚至增强其抑菌等重要的生物学功能，一直是医药学研究的任务。本研究的主要内容如下：
1.优化的蜂毒素分子设计：根据检索Genbank得到蜂毒素氨基酸全序列，推导出蜂毒素基因。由于蜂毒素分子结构中第12位的甘氨酸处于连接呈120°弯曲部位的两个螺旋之间，为探讨该部位对蜂毒素生物学功能的影响，本研究在蜂毒素原始序列基础上，设计将第12位的甘氨酸删除(Mel—Ⅰ)，使分子的弯曲近似于消失状态，降低分子构象变化的灵活性；同时将第12位的甘氨酸替换成形成螺旋能力较强的甲硫氨酸(Mel—Ⅱ)。将以上两条序列在酵母细胞进行表达；为研究分子结构中正电荷对蜂毒素生物活性的影响，本研究还设计了一条将25、26位的Gln分别替换为Lvs一25，Arg-26的序列(Mel—Ⅲ)。根据毕赤酵母及大肠杆菌遗传密码子的偏爱性，设计了三条突变的蜂毒素基因全长序列。
2.优化的蜂毒素基因合成：采用酶促法合成蜂毒素基因，分别合成末端有互补碱基区域的两条寡核苷酸片段，在5’端和3’端分别带有EcoR I和Sal I酶切位点(构建原核载体基因的酶切位点为Nco I和Sal I)。在PCR扩增仪上退火，以重叠区为引物，在四种dNTP存在下，通过Taq DNA聚合酶作用，分别获得三条完整的5’端和3’端分别带有限制性酶切位点的蜂毒素全基因。
3．改造后蜂毒素基因在Pichia pastoris中的表达：将设计合成的蜂毒素基因经过双酶切后与载体pPICZα-A连接，产物经热激法转化Ecoli DH5a，筛选阳性单菌落，经酶切、PCR鉴定、测序确认，获得含蜂毒素基因的重组表达载体。重组质粒经大量扩增，抽提，电击法转化到P.pastoris宿主菌GS115中。抗生素筛选阳性单菌落，PCR确认，经生物活性鉴定，Tricine—SDS—PAGE小分子量蛋白电泳分析证实，两条突变的蜂毒素基因均已整合到P.pastoris基因组中，外源基因得到了表达。
4．突变的蜂毒素基因在大肠杆菌中表达：将合成的Mel—Ⅲ基因经酶切后克隆到原核穿梭载体PET-32(a)中，通过CaCl<,2>法转入Ecoli DH5α，筛选阳性单菌落，经酶切、PCR鉴定、测序确认，获得重组表达载体。经大量扩增，抽提质粒，热激法转化到表达载体Ecoli BL21中，裂解菌体，获得融合表达的蛋白，经SDS-PAGE分析，肠激酶水解，去除融合的蛋白，检测抑菌活性。研究证实，目的基因已克隆到表达载体中，突变后的蜂毒素：Mel-Ⅲ对大肠艾希氏菌有一定的抑菌活性。
5.基因表达蜂毒素的生物活性鉴定：研究结果显示，转化到宿主菌中突变的蜂毒素基因在真核和原核细胞中均得到了表达，在真核细胞中两条序列的表达量分别为Mel-Ⅰ：145.01μg/mL、Mel-Ⅱ：67.64μg/mL；在原核细胞中一条序列的表达量为Mel-Ⅲ：512.38μg/mL。比较产物的表达量，原核表达量高于真核表达。对表达的蜂毒素进行抑菌和溶血活性测定。结果证明，删除12-Gly后的蜂毒素抑菌活性明显增强，而12-Gly替换为12-Met及将25、26-Gln替换为25-Lys，26-Arg所得到的表达产物抑菌活性变化较小。三条突变的蜂毒素溶血活性测定结果为：Mel-Ⅱ最大，Mel-Ⅰ次之，Mel-Ⅲ最小。由以上结果得出结论：为减弱蜂毒素的溶血活性并保留或增强抑菌作用，应该保留多肽分子中间的铰链结构，同时减弱分子的螺旋度以及增加分子的正电荷数量。