论文部分内容阅读
长期大量使用化学农药，造成的环境污染及危害是极其严重的。如何减轻化学农药污染，保护人类生存环境，是我们目前急需解决的重要课题。大量使用化学农药同时也导致加速昆虫抗性进化。转基因策略，在持续地表达毒素的选择压力下，也可诱导加速害虫产生抗性。因此，使用昆虫杆状病毒表达神经毒素杀虫剂可能是防治具有高抗性害虫策略之一。ω-atracotoxin-Hv2a(ω-ACTX-Hv2a)蜘蛛毒素，属于昆虫特异性毒素，对环境无污染，对脊椎动物及非靶性目标无毒。ω-ACTX-Hv2a对很多害虫都有杀伤作用，包括鳞翅目、双翅目和直翅目。到目前为止，ω-ACTX-Hv2a是发现的昆虫钙通道最有效的、特异性最高的抑制剂。也可能是研制成为最好的昆虫杀虫剂。口服ω-atracotoxin是没有杀虫活性的，因此，转基因植物表达毒素控制害虫不可能是有效途径。利用重组杆状病毒在昆虫体内表达ω-ACTX-Hv2a控制目标害虫可能是更为有效的方法。然而，普通的昆虫杆状病毒表达载体系统表达外源基因要受病毒潜伏期和病毒复制等因素的影响，其表达水平不稳定，严重影响其杀虫效果。本研究所组建的重组昆虫杆状病毒高效表达模型，以杆状病毒为运载体，携带能被昆虫细胞识别的启动子，构建其表达不再受杆状病毒消长的控制，而是由昆虫细胞能识别启动子调控的表达体系。其理论上，所组建的新型重组病毒感染宿主昆虫后，因昆虫细胞对昆虫杆状病毒没有特异性蛋白受体，致使该重组病毒粒子能进入被感染昆虫细胞，并将其所携带的昆虫特异表达元件运送到细胞核。表达元件进入细胞核后。昆虫启动子受昆虫细胞特异因子的调控激活，进行转录，驱动外源基因进行表达，其表达调控已与昆虫杆状病毒复制与否没有直接关联，因此，本研究所组建的表达模型，有望探索解决昆虫杆状病毒作为杀虫剂杀虫速度较慢及宿主范围狭窄问题的新方法。本研究分别以AcNPV(Nuclear Polyhedrosis Virus)pAcEl(载有昆虫特异表达元件)和pVL1392为载体，成功的组建了荧光素酶报告基因的重组病毒表达模型(rbpAcEl-Lu和rbpVL-Lu)；经SF9昆虫细胞表达结果表明，直接受昆虫特异表达元件(Cassette)调控的rbpAcEl-Lu重组病毒，感染SF9细胞24h后荧光素酶即得到高水平的表达，而对照重组病毒rbpVL-Lu的表达活性却很低。在此基础上。(1)采用分段合成方法，设计和人工合成了分泌型ω-ACTX-Hv2a昆虫特异性毒素基因，并将其克隆至PCR-Blunt载体中，经DNA序列分析证实，合成基因的序列与设计序列相比，有5个碱基缺失，后经定点突变技术修复，最终使合成基因序列与设计序列一致：(2)以pAcEl为载体，成功的构建了表达分泌型ω-ACTX-Hv2a昆虫毒素基因转移载体pAcE1-Hv2a，并组建了重组昆虫杆状病毒rbpAcE1-Hv2a，(3)将所组建的重组昆虫杆状病毒rbpAcEl-Hv2a，与对照野生型昆虫杆状病毒经体壁感染2龄松毛虫幼虫，重组昆虫杆状病毒rbpAcEl-Hv2a，能够杀死供试昆虫，死亡的虫体收缩变硬，呈典型神经中毒症状，与感染WT昆虫杆状病毒死亡的虫体组织液化状态截然不同，表明：载有昆虫特异表达元件的重组杆状病毒具有表达分泌功能；所合成的分泌型ω-ACTX-Hv2a蜘蛛毒素基因在供试昆虫体内得到了正确的表达，并且毒素基因在杀虫过程中起着重要作用，其LT50较野生病毒缩短了近50小时。本研究为研制新型高效昆虫杆状病毒生物杀虫剂提供了重要的理论依据与技术支撑。结论1)以pACE1昆虫杆状病毒杂合载体为转移载体，构建了荧光素酶(Lu)报告基因的转移模型载体pAcE1-Lu；同时构建了含有荧光素酶报告基因的普通转移载体pVL1392-Lu。经酶切鉴定，准确无误；2)将所构建的新型杆状病毒转移载体pAcE1-Lu质粒DNA和普通昆虫杆状病毒转移载体pVL1392-Lu质粒DNA分别与线性AcNPV DNA共转染SF9昆虫细胞，组建重组病毒(rbpAcE1-Lu和rbpVL1392-Lu)，并测定了两种重组病毒表达荧光素酶的活性。结果表明：所构建的新型重组杆状病毒rbpAcE1-Lu的荧光素酶基因在感染SF9和SL-2昆虫细胞24h后得到高效表达，而对照普通昆虫杆状病毒表达载体rbpVL1392-Lu，24h后表达的活性非常低，其表达水平不足rbpAcE1-Lu表达的1／10；3)采用分段合成法，人工合成了分泌型蜘蛛毒素肽基因ω-ACTX-Hv2a，并含有蜘蛛毒素ω-ACTX-Hs2a的信号序列和前导DNA序列。4)用定点突变方法，将分泌型蜘蛛毒素肽基因ω-ACTX-Hv2a在合成过程中发生的5处序列缺失进行了2次基因突变修补，修饰后的DNA序列，经测序鉴定，与设计序列一致。5)采用3个DNA片段连接法，将Hv2a基因克隆到转移载体pAcE1中，构建了pAcE1-Hv2a转移载体，经酶切验证，准确无误；并组建了rbpAcE1-Hv2a重组病毒。6)以AcNPV WT病毒为对照，对组建的新型rbpAcE1-Hv2a重组病毒进行了杀虫效果室内生物测定，结果表明：新型rbpAcE1-Hv2a重组病毒能够杀死供试害虫，其杀虫速度显著快于AcNPV WT病毒对照，其LT50缩短近50h；并且致死害虫呈明显中毒死亡症状。