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白细胞介素-21(IL-21)是2000年发现的由CD4+T细胞分泌的I型细胞因子。IL-21在其他细胞因子或刺激因子协同作用下能够对B细胞、T细胞和NK细胞的生长以及功能效应发挥广泛的调节作用。成熟人IL-21相对分子质量(Mr)是15000，由131个氨基酸形成四螺旋束状结构域，与IL-2、IL-4和IL-15具有同源性。其生物学效应是通过I型细胞因子受体IL-21R(IL-21Ra)介导的，但是必须与共用受体γ链(γc)结合才能介导完整的生物学效应。γc也是IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-15的共用受体。IL-2l主要来源于活化的CD4+T细胞。近期研究发现NKT细胞可能是潜在分泌IL-21的重要细胞，通过分泌IL-21介导对B、T、NK细胞和自身的免疫调节。
IL-21Ra是一种新的白细胞介素受体(NILR)，它包含四个保守的半胱氨酸残基，一段Trp-Ser-X-Trp-Ser基序，一段IL-2Rβ链高度保守的氨基酸序列。同IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-15相似，IL-21活化JAK家族蛋白酪氨酸激酶JAK-1和JAK-3，其中JAK-1结合IL-21R亚单位，JAK-3结合于共同丫链。与其他γc家族细胞因子不同的是，这两个激酶主要介导IL-21依赖的STAT1和STAT3的活化，而不是STAT5A和STAT5B的活化。IL-21R通常广泛表达于T细胞、B细胞、NK细胞和一些骨髓细胞及角化细胞表面。
研究表明IL-21对NK、T及B等各种免疫细胞介导广泛的生物学效应。IL-21对B细胞的发育或者增殖的影响并不明显，不起主要作用，甚至引起B细胞凋亡，但研究表明IL-21能促进B细胞类别转换、浆细胞的分化并在不同的微环境下对B细胞功能产生不同的调节，表现为功能的多态性。IL-21和IL-4都作为免疫球蛋白(Ig)的广泛调解因子共同调节IgG和IgE的类别转换及Ig的合成。IL-21和IL-15协同诱导naive(CD44low)和memory(CD44hi)CD8+T细胞的增殖，增加产生IFN-γ的CD8+T数量，诱导颗粒酶B基因的表达，这表明IL-21不仅能协同促进T细胞的克隆增殖还能增强T细胞的功能效应。IL-21单独不能使NK细胞增殖或存活，甚至会增加NK细胞凋亡率。低剂量的IL-21能够协同IL-2或IL-15促进NK细胞的增殖，高剂量的IL-21却抑制NK细胞的增殖，但这种抑制同时伴随着向大颗粒淋巴细胞表型的转化，产生高水平的穿孔素和IFN-γ，增强NK细胞细胞毒活性。考虑到IL-21对NK细胞功能的影响时，往往离不开NK细胞表面受体方面的研究。NKG2D是NK细胞重要的活化性受体，曾有研究表明IL-21可以通过NKG2D机制增强肿瘤模型鼠的抗肿瘤效应。但是也有文献报道IL-21通过负调节接头分子DAP10的基因表达而下调人primaryNK和CD8+T细胞表面NKG2D/DAP10的表达，从而抑制primaryNK细胞通过NKG2D介导的细胞毒作用。这可能是由种属差异造成的。
本实验拟通过构建含IL-21基因的原核表达载体，优化rhIL-21的表达条件；探索rhIL-21包涵体蛋白质最佳复性条件；用Ni-NTA亲和层析柱纯化出高纯度的rhIL-21，为大量生主rhIL-21及其生物学研究或临床应用奠定基础。在此基础上以NK92细胞为效应细胞，通过对NK92细胞的增殖和杀伤功能的影响以及对表面活化性受体NKG2D的表达的分析，来初步探讨IL-21对NK细胞的生物学作用。
方法和结果：
1.人IL-21基因的克隆和分析
根据Genebank报告的人类IL-21基因序列，我们设计一对编码人IL-21成熟肽的引物。上游包含NdeI酶切位点，下游含XhoI酶切位点。
以本实验室保存的重组质粒pcDNA3-IL-21为模板，用所设计的引物扩增出IL-21目的基因。PCR片段用低熔点琼脂糖凝胶分离纯化并与TA载体pMD18-T连接，转化到DH5α感受态细胞，平铺于含100μg/ml氨苄西林的LB培养板上筛选阳性克隆。再通过PCR、双酶切及测序方法对阳性克隆进行鉴定，结果表明成功构建了pMD18-T-IL-21重组克隆载体，且无基因突变。
2.重组表达载体pET-30a(+)-IL-21的构建及对rhIL-21表达条件的优化
用NdeI和XhoI对pMD18-T-IL-21和载体pET-30a(+)进行双酶切反应，低熔点琼脂糖回收目的片段和经双酶切后的pET-30a(+)，用T4连接酶进行连接反应，连接复合物转化入感受态大肠杆菌DH5α中，平铺于含50μg/ml卡那霉素的LB培养板上筛选阳性克隆。先通过对阳性克隆菌落进行PCR分析，对PCR结果阳性的克隆提取质粒进行双酶切和基因测序鉴定。提取重组表达质粒pET-30a(+)-IL-21，并转化入感受态大肠杆菌BL21中，在含50μg/ml卡那霉素的LB板上得到单克隆工程菌BL21/pET-30a(+)-IL-21。
挑取单克隆接种于10ml含卡那霉素(50μg/ml)的LB培养液，37℃活化培养。取活化后菌液接种到新的含卡那霉素的LB培养液中，37℃培养至A600nm=1.0～1.2时，以不同的接种比例接种于LB培养液形成不同起始诱导浓度梯度，然后观察温度、诱导时间和IPTG浓度对目的蛋白质表达量的影响。收集工程菌用SDS-PAGE和WesternBlot分析目的蛋白质表达情况。结果表明42℃是本工程菌发酵的最佳温度，初始密度A600nm为0.2和0.4时蛋白质表达量较高(分别为34％和32％)。
按上述发酵方法对表达菌株发酵培养，收集工程菌离心，超声波破菌，再低温高速离心，收取上清和沉淀，用14％聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE电泳分析。结果表明本工程菌表达的目的蛋白是以包涵体形式存在的。
3.包涵体的复性和目的蛋白质的纯化
收集诱导4h的工程菌菌液500ml，3000rpm×10min离心后用50mlBufferA重悬，用超声波破菌仪破菌，200～300W，10min工作，10min间歇，全程20min。12,000g×30min离心，收集包涵体。用40mlBufferB洗涤包涵体沉淀，12，000g×30min离心获得包涵体。包涵体用含8M尿素的20mlBufferC悬起置4℃冰箱8h以上，12,000g×30min离心，弃沉淀。溶解上清中加180mlbufferC稀释包涵体浓度至0.2～0.3mg/ml。移至透析袋内，依次于含0.01％SDS的500mlBufferD、500mlBufferE透析8小时以上，最后在不含有SDS的500mlBufferF中4℃透析8h以上，12,000g×30min离心，弃沉淀，得到复性后蛋白质。得到的上清液进行SDS-PAGE电泳分析，并用考马斯亮蓝G-250染色法测蛋白质浓度。结果表明本方法蛋白质复性得率达到30％～35％。
根据Ni-NTASepharose操作说明纯化6×Histag目的蛋白质：吸取2ml50％的Ni-NTASepharose装柱；把复性后上清液缓慢加入到Ni-NTA柱上；用1ml的washingbuffer洗柱4次；1mlelutionbuffer洗脱4次，分管收集，用SDS-PAGE分析蛋白质分布。结果表明在洗脱的第二管可以得到大部分目的蛋白质，纯度大于90％。纯化的rhIL-21用0.22μm的微孔滤膜过滤，4℃保存。
4.rhIL-21的生物学活性检测
取对数生长期的NK92细胞，于96孔板中接种培养48h后，细胞计数板计数观察不同浓度的rhIL-21对NK92细胞增殖的影响；同时用MTT法检测rhIL-21刺激的NK92细胞对几种肿瘤细胞的杀伤效应。结果表明rhIL-21协同IL-2能够促进NK92细胞的增殖，并增强NK92细胞的细胞毒活性。
结论：
1)成功构建了重组表达载体pET-30a(+)-IL-21，建立了rhIL-21在大肠杆菌BL21中的最佳表达条件，rhIL-21表达量占菌体蛋白质的32％～34％，目的蛋白质主要以包涵体形式存在。
2)初步建立了包涵体复性策略，复性回收率可以达到30％～35％。用Ni-NTA亲和层析柱纯化可以得到纯度＞90％的rhIL-21。
3)初步得到了具有生物学活性的rhIL-21。试验数据显示rhIL-21能协同IL-2促进NK92细胞的增殖和增强NK92细胞的细胞毒效应。