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植物虫害和真菌病害的种类繁多，难以防治，常常给农业生产带来重大的损失，微生物代谢产物来源的高效、低毒的生物农药一直是国内外的研究热点。但是，在微生物代谢产物农药的研发过程中仍有许多关键技术尚待创新和完善，如菌种改良技术，发酵调控技术、发酵工艺过程放大及其动力学建立等。 依托本实验室分离获得的具有高效杀虫活性的淡色生赤壳菌（Bionectria ochroleuca）YLZ42和广谱低毒的抗真菌剂——伊枯草菌素(Iturin)，论文研究了这2种微生物源农药研发的部分关键技术，如淡色生赤壳菌的菌株改良选育及其发酵条件优化、伊枯草菌素的中试发酵动力学研究等，以期为微生物代谢产物农药研发提供新的方法和技术，并为推动其研究开发为新型杀虫和抗真菌生物农药奠定基础。 论文主要包括以下三章的研究内容和结果: 第一章:淡色生赤壳菌（B.ochroleuca）YLZ42的诱变育种 以淡色生赤壳菌(B.ochroleuca)YLZ42为出发菌株进行了诱变育种研究，以期获得杀虫活性物质产量提高的高产突变株，为后续分离纯化杀虫代谢产物，并将其开发为生物杀虫剂提供基础: 为了指示淡色生赤壳菌YLZ42发酵液中杀虫活性物质的含量，研究了以阿维菌素杀虫活性为参照标准的含量标准曲线，建立了回归方程，其线性相关系数R2=0.9916，表明一剂量法标准曲线服从朗伯比尔定律，有较好的线性关系。 生赤壳菌属（Bionectria sp.）真菌的孢子壁较厚，为了增加孢子对诱变剂的敏感性，提高正突变株的产生机率，研究了菌株YLZ42的孢子萌发规律，根据萌发孢子芽管长短，选择了萌发2h的孢子作为诱变材料; 诱变育种的正突变率一般较低，且检测菌株YLZ42产杀虫活性物质活性的方法需要先收集发酵液，再进行卤虫致死实验，每天只能分析几十个样品，筛选工作量非常大，因此需要建立一种高效、快速、简单、易操作的筛选方法。本研究根据淡色生赤壳菌的生长特性、杀虫活性代谢产物的产生时间及其对卤虫的杀灭效果，以24孔板为载体，建立了集培养产素与杀虫活性检测为一体的高通量筛选模型，结果表明，孔间和板间的校正致死率相对标准偏差均小于5％，说明该筛选模型用于正突变株的检出是可行的，能够有效地减少筛选工作量，提高筛选出正突变菌株的机率; 由于生赤壳菌属（Bionectria sp.）的菌株无任何相关基因组信息，其遗传背景极不明确，并且，菌株YLZ42的杀虫代谢产物成分不清楚，所以无法采用分子生物学技术对该菌株进行遗传改良，紫外线是一种应用广泛、效果明显的微生物物理诱变剂，因此本论文对菌株YLZ42首先采用了紫外诱变育种技术进行诱变处理。研究了紫外线照射时间对出发菌株YLZ42萌发孢子存活率的影响，结果表明，以波长253.7nm、功率15W、灯距27cm的紫外灯照射萌发孢子20s时，致死率可达到90％左右，在该诱变条件下，对淡色生赤壳菌YLZ42的萌发孢子进行诱变处理，结合24孔板初筛模型进行初筛，并经摇瓶复筛，选育获得了3株杀虫活性代谢产物产量提高30％以上的突变株，其中突变株YLZ42-32所产杀虫活性物质的产量提高了39.6％。 第二章:淡色生赤壳菌(B.ochroleuca)突变株YLZ42-32产杀虫活性物质发酵条件研究 为解决突变株YLZ42-32斜面培养时孢子形成的不稳定性，为后续摇瓶发酵条件的优化提供稳定的斜面种子，研究确定了斜面培养基培养突变株YLZ42-32时的最佳产孢条件，即:pH6.2的PDA培养基于28℃光照培养5d; 在此基础上，通过摇瓶液体培养，优化筛选出突变株YLZ42-32产素的最适发酵培养基，并对影响菌株YLZ42-32产素的相关因素（初始pH、温度、转速等）进行了优化，确定了摇瓶发酵培养条件，为进一步提高突变株YLZ42-32产杀虫活性物质的摇瓶发酵产量，开展后续实验研究提供了可靠的技术参数: 首先采用单因素试验设计系统地考察了不同种类的碳源、氮源、无机盐及其浓度对菌株YLZ42-32产生杀虫活性物质的影响，得到较优的发酵培养基:20.0g/L乳糖，2.0g/L花生饼粉，2.0g/L黄豆饼粉，10.0g/L麦麸、0.8g/L KH2PO4，0.05g/L MnSO4。正交设计试验是通过规格化的正交表对实验因素和水平进行组合，均匀搭配，可以极大地减少实验次数，并且能够提供较多的信息。因此，根据单因素试验的结果，设计了正交试验的各因素（乳糖、麦麸、MnSO4）及其水平，结果表明，各因素对菌体合成杀虫活性物质的影响都极显著，影响的主次顺序为:乳糖＞MnSO4＞麦麸。通过优化培养基各营养成分的配比，得到最优的发酵培养基:20.0g/L乳糖，2.0g/L花生饼粉，2.0g/L黄豆饼粉，20g/L麦麸、0.8g/L KH2PO4，0.01g/L MnSO4。用其培养菌株YLZ42-32，发酵液杀虫活性物质的相对含量为70.3ug/mL，较发酵基础培养基增加了1.2倍。在此基础上，优化了摇瓶发酵培养参数，得到最适合的培养条件是:发酵培养温度为26℃，最适合初始pH为7.3，摇床转速是150r/min，在250mL三角瓶中装40mL培养基。 以优化后的培养基配方和培养条件培养突变株YLZ42-32，其杀虫活性物质的相对含量为87.8ug/mL，比优化前的相对含量(31.4ug/mL)提高了1.8倍，表明发酵条件的优化效果是明显的。 第三章:伊枯草菌素2000L发酵罐发酵动力学研究 采用“碳源+氮源+3种氨基酸(Asp、Glu、Pro)”混合补料分批发酵工艺，在2000L发酵罐上进行了伊枯草菌素中试放大发酵生产，成功运行了3个批次，每批次伊枯草菌素的效价达到34000单位以上。 取三次重复的伊枯草菌素中试补料分批发酵过程数据的平均值作为动力学模型构建的数据，采用分段拟合的方式，通过Origin8_v8.07软件计算、分析，确定不同的数学模型（包括Sigmoid模型的Boltzmann函数和Slogistic函数、线性函数、Exponential模型的ExpDec2函数）对2000L发酵罐上补料分批发酵工艺中的细胞生长、还原糖消耗、总氮消耗、伊枯草菌素合成以及3种氨基酸消耗分别进行动力学拟合和分析，并进行方差分析。建立了在2000L发酵罐放大发酵工艺过程中细胞生长、还原糖消耗、总氮消耗、伊枯草菌素合成和3种氨基酸消耗的动力学模型。 其中:细胞生长动力学模型为: y={0.72-54.19/1+e(x-8.98)/1.78+54.190≤x≤1415583.32-33.73/1+e(x+95.82)/162.6+33.7314≤x≤48 还原糖消耗动力学模型为: y={37.33-24.58/1+e（x-5.95)/1.09+24.580≤x≤9-200097-30.6/1+e(x-2.62)/0.77+30.699≤x≤1536.63-4.45/1+e(x-22.68)/5.65+4.4515≤x≤48 总氮消耗动力学模型为: y={2.73-1.45/1+e（x-6.99）/1.84+1.450≤x≤101.46+0.024x10≤x≤151.72-165.31/1+e(x-172.47)/21.6+165.3115≤x≤48 Iturin合成动力学模型为: y={72.08-1821401/1+e(x-10.10)/0.75+18214010≤x≤126107015-3702.28x12≤x≤153017970/1+e[-0.57×(x-17.34)]15≤x≤48 Asp消耗动力学模型为: y={1071.61-2.17/1+e(x-4.31)/0.58+2.170≤x≤48 Glu消耗动力学模型为: y=417.98-5.83/1+e(x-3.90)/0.63+5.830≤x≤48 Pro消耗动力学模型为: y={140.88-6.44/1+e(x-3.37)/0.35+6.440≤x≤62.14×10-19×ex/0.29+59.24×ex/3050-61.306≤x≤1341.07-14.59/1+e(x-14.02)/0.04+14.5913≤x≤48 对模型的方差分析表明，以上拟合模型的P值均小于0.05，表明这些模型非常显著，具有很好的适应性，通过实验数据对模型进行验证，发现拟合曲线与发酵参数的变化规律吻合度较高。根据拟合方程，分别计算出细胞比生长、还原糖消耗、总氮消耗、伊枯草菌素合成和Asp消耗、Glu消耗、Pro消耗的最大比速率分别为0.436h-1、0.051h-1、0.003h-1、34.827h-1、110.528h-1、43.045h-1和27.156h-1。通过分析比速率曲线发现:氨基酸和碳氮补料促进了菌体细胞对底物的消耗，延长了伊枯草菌素合成时间，促进了伊枯草菌素的合成，且对伊枯草菌素合成的影响比对生物量增长的影响明显;细胞增长、伊枯草菌素合成、还原糖消耗和总氮消耗之间是部分偶联关系，而细胞增长和氨基酸消耗之间是完全偶联关系。 通过建立的各动力学模型，可以实时计算并预测出伊枯草菌素发酵过程中任一时刻的生长、合成和消耗速率，了解其发酵过程变化规律，并在此基础上对发酵工艺进行主动调控，优化发酵参数和补料速率，提高伊枯草菌素的发酵产量和效率。