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肝癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，我国肝癌发病率居全球之首，每年新发病例和死亡患者约占全球总数的一半。目前肝癌患者的5年生存率仅为15%，因此迫切需要加强肝癌的发病和演进机制研究，为肝癌的早期诊断、有效治疗靶点寻找、新治疗策略制定提供理论基础。肿瘤干细胞是肿瘤中一小群干细胞样的肿瘤细胞亚群，具有起始肿瘤、多向分化、放化疗抵抗、免疫耐受和高度的侵袭转移能力。肿瘤干细胞的存在被认为是肿瘤发生发展、复发转移的根源，因此破译肿瘤干细胞干性维持的分子机制，是实现肿瘤治疗突破的一个重要方向。近年来，科学家已利用CD133、EpCAM、CD13、CD90、CD24、Nanog等标志物分子证明了肝癌干细胞的存在，但肝癌干细胞复杂的自我更新调控网络仍不完全清晰，有待更深入地研究。
Wnt/β-catenin信号通路在胚胎发育，以及肿瘤发生和演进中发挥重要作用。Tcf7l1作为Wnt信号通路下游的重要效应分子，不但参与胚胎干细胞和成体干细胞的自我更新调控，也参与多种恶性肿瘤的发生发展。Tcf7l1在我国高发肝癌中的表达和功能仍缺乏较为系统的研究。本课题组在前期肝癌干细胞的相关研究中发现，Tcf7l1是miRNA449a的一个重要靶基因，miRNA449a可通过调节Tcf7l1的表达，参与肝癌干细胞的自我更新调控。然而，Tcf7l1在肝癌临床样本中的表达模式以及在调控肝癌干细胞自我更新中的作用机制仍然不明确。
因此，本研究将重点对Tcf7l1在肝癌中的作用展开研究，探究Tcf7l1在肝癌中的表达模式及其临床意义，发掘Tcf7l1在肝癌干细胞自我更新调控中的具体作用机制，并进一步阐释Tcf7l1的上游调控信号通路。
主要的研究内容和研究结果如下：
1.发现Tcf7l1在肝癌组织中低表达，且与肝癌患者的病理分级、临床分期呈负相关，Tcf7l1高表达的肿瘤患者生存期更长
免疫组化检测Tcf7l1在90例配对的肝癌和癌旁组织样本的表达情况，结果发现Tcf7l1在肝癌组织中显著低于癌旁组织。通过比较Tcf7l1的表达与临床病理指标的相关性，发现Tcf7l1的表达水平与病理分级和临床分期显著负相关，而与患者生存时间呈正相关，即Tcf7l1高表达的肝癌患者生存时间更长，这些结果提示Tcf7l1与肝癌进程相关，可能在肝癌中发挥重要作用。
2.体内外研究证明Tcf7l1能够抑制肝癌干细胞的自我更新
比较Tcf7l1在肝癌干细胞和非肝癌干细胞中的表达，发现Tcf7l1在肝癌干细胞中低表达，并且随着肝癌干细胞的分化Tcf7l1表达水平逐渐升高，提示Tcf7l1
可能与肝癌干细胞干性状态密切相关。通过在肝癌干细胞中过表达Tcf7l1分子，发现可导致干性相关基因的下调，以及分化基因的表达上调。功能上，Tcf7l1过表达，显著抑制肝癌干细胞的克隆形成能力和成球生长能力，同时增加肝癌干细胞对化疗药物的敏感性。小鼠体内成瘤实验证明，Tcf7l1过表达能够抑制肝癌干细胞的动物体内成瘤能力，并抑制肿瘤的生长速度。
3.证明Tcf7l1通过转录抑制干性基因Nanog，调控肝癌干细胞的自我更新
蛋白免疫印迹检测显示Tcf7l1和干性转录因子Nanog在肝癌组织中的表达呈显著负相关，染色质免疫沉淀和荧光素酶报告实验证明，Nanog是Tcf7l1的直接靶基因，Tcf7l1可以调控Nanog的转录。进一步在非肝癌干细胞中干扰Tcf7l1，结果显示干扰Tcf7l1上调Nanog的mRNA水平和蛋白水平。功能上，干扰Tcf7l1显著提高非肝癌干细胞的克隆形成能力和成球能力，然而，这种作用可在进一步干扰Nanog后被阻断，由此证明Tcf7l1经由Nanog分子调控肝癌细胞的自我更新。
为了进一步明确Tcf7l1的调控作用是否依赖于β-catenin的结合，本研究构建β-catenin结合缺陷的截短形式的Tcf7l1表达载体。通过比较截短和全长形式的Tcf7l1对肝癌干细胞自我更新的作用，发现截短的Tcf7l1同样可以下调Nanog的表达，抑制肝癌干细胞的自我更新能力，且与全长Tcf7l1无显著差异。结果证明Tcf7l1对肝癌干细胞自我更新的调控作用不依赖于β-catenin。
4.发现Tcf7l1可受微环境IGF信号调控，并参与IGF信号通路对肝癌干细胞自我更新的调控
通过检测分析与肝癌干细胞自我更新维持密切相关的EGF、bFGF、IGF2和IL6信号通路对Tcf7l1的表达调控，结果发现在肝癌干细胞中，Tcf7l1可响应上游IGF调节信号。阻断IGF信号可上调Tcf7l1的表达，同时抑制下游Nanog基因，并降低肝癌干细胞的自我更新能力，而且这种抑制作用在干扰Tcf7l1后能得到部分恢复。从而证明，Tcf7l1是IGF信号通路调控肝癌干细胞自我更新的一个重要分子。
5.阐明IGF信号通过MEK/ERK通路调控Tcf7l1磷酸化过程，并影响其蛋白稳定性
通过检测IGF信号抑制前后Tcf7l1mRNA和蛋白水平变化，发现IGF信号通路主要通过蛋白水平调控Tcf7l1的表达。机制上，IGF信号经由MEK/ERK通路提升Tcf7l1蛋白的磷酸化水平，进而Tcf7l1蛋白被泛素化降解。抑制IGF信号或使用ERK抑制剂可解除该调控作用。因此，本研究首次发现IGF信号通过MEK/ERK通路调控Tcf7l1蛋白磷酸化和泛素化降解。
6.证明IGF信号通路对Tcf7l1的调控不依赖于β-catenin
通过构建β-cateninCRISPR质粒，筛选出β-catenin基因敲除的肝癌细胞单克隆株。通过构建β-catenin基因敲除的肝癌细胞株检测IGF信号通路对Tcf7l1表达，证明β-catenin基因不影响IGF信号通路对Tcf7l1表达的调控，β-catenin基因的敲除也不影响Tcf7l1蛋白泛素化，从而证明IGF信号通路调控Tcf7l1的表达不依赖于β-catenin。
综上所述，本研究发现，不同于在其他类型肿瘤中的促瘤作用，Tcf7l1在肝癌中对肿瘤的起始和进展起抑制作用；Tcf7l1在肝癌中低表达，并且其表达水平与患者预后显著相关；在肝癌干细胞中，Tcf7l1通过转录抑制Nanog基因调控细胞的自我更新能力；更重要地，本研究发现IGF信号通过MEK/ERK通路调控Tcf7l1的磷酸化和泛素化降解，这是除Wnt/β-catenin信号通路调控Tcf7l1外的一种新调控途径。本研究丰富了Tcf7l1在肿瘤中的功能，对细胞外信号如何调控肝癌干细胞自我更新提供了新的理解，为开发针对肝癌干细胞治疗药物提供了理论支撑。
Wnt/β-catenin信号通路在胚胎发育，以及肿瘤发生和演进中发挥重要作用。Tcf7l1作为Wnt信号通路下游的重要效应分子，不但参与胚胎干细胞和成体干细胞的自我更新调控，也参与多种恶性肿瘤的发生发展。Tcf7l1在我国高发肝癌中的表达和功能仍缺乏较为系统的研究。本课题组在前期肝癌干细胞的相关研究中发现，Tcf7l1是miRNA449a的一个重要靶基因，miRNA449a可通过调节Tcf7l1的表达，参与肝癌干细胞的自我更新调控。然而，Tcf7l1在肝癌临床样本中的表达模式以及在调控肝癌干细胞自我更新中的作用机制仍然不明确。
因此，本研究将重点对Tcf7l1在肝癌中的作用展开研究，探究Tcf7l1在肝癌中的表达模式及其临床意义，发掘Tcf7l1在肝癌干细胞自我更新调控中的具体作用机制，并进一步阐释Tcf7l1的上游调控信号通路。
主要的研究内容和研究结果如下：
1.发现Tcf7l1在肝癌组织中低表达，且与肝癌患者的病理分级、临床分期呈负相关，Tcf7l1高表达的肿瘤患者生存期更长
免疫组化检测Tcf7l1在90例配对的肝癌和癌旁组织样本的表达情况，结果发现Tcf7l1在肝癌组织中显著低于癌旁组织。通过比较Tcf7l1的表达与临床病理指标的相关性，发现Tcf7l1的表达水平与病理分级和临床分期显著负相关，而与患者生存时间呈正相关，即Tcf7l1高表达的肝癌患者生存时间更长，这些结果提示Tcf7l1与肝癌进程相关，可能在肝癌中发挥重要作用。
2.体内外研究证明Tcf7l1能够抑制肝癌干细胞的自我更新
比较Tcf7l1在肝癌干细胞和非肝癌干细胞中的表达，发现Tcf7l1在肝癌干细胞中低表达，并且随着肝癌干细胞的分化Tcf7l1表达水平逐渐升高，提示Tcf7l1
可能与肝癌干细胞干性状态密切相关。通过在肝癌干细胞中过表达Tcf7l1分子，发现可导致干性相关基因的下调，以及分化基因的表达上调。功能上，Tcf7l1过表达，显著抑制肝癌干细胞的克隆形成能力和成球生长能力，同时增加肝癌干细胞对化疗药物的敏感性。小鼠体内成瘤实验证明，Tcf7l1过表达能够抑制肝癌干细胞的动物体内成瘤能力，并抑制肿瘤的生长速度。
3.证明Tcf7l1通过转录抑制干性基因Nanog，调控肝癌干细胞的自我更新
蛋白免疫印迹检测显示Tcf7l1和干性转录因子Nanog在肝癌组织中的表达呈显著负相关，染色质免疫沉淀和荧光素酶报告实验证明，Nanog是Tcf7l1的直接靶基因，Tcf7l1可以调控Nanog的转录。进一步在非肝癌干细胞中干扰Tcf7l1，结果显示干扰Tcf7l1上调Nanog的mRNA水平和蛋白水平。功能上，干扰Tcf7l1显著提高非肝癌干细胞的克隆形成能力和成球能力，然而，这种作用可在进一步干扰Nanog后被阻断，由此证明Tcf7l1经由Nanog分子调控肝癌细胞的自我更新。
为了进一步明确Tcf7l1的调控作用是否依赖于β-catenin的结合，本研究构建β-catenin结合缺陷的截短形式的Tcf7l1表达载体。通过比较截短和全长形式的Tcf7l1对肝癌干细胞自我更新的作用，发现截短的Tcf7l1同样可以下调Nanog的表达，抑制肝癌干细胞的自我更新能力，且与全长Tcf7l1无显著差异。结果证明Tcf7l1对肝癌干细胞自我更新的调控作用不依赖于β-catenin。
4.发现Tcf7l1可受微环境IGF信号调控，并参与IGF信号通路对肝癌干细胞自我更新的调控
通过检测分析与肝癌干细胞自我更新维持密切相关的EGF、bFGF、IGF2和IL6信号通路对Tcf7l1的表达调控，结果发现在肝癌干细胞中，Tcf7l1可响应上游IGF调节信号。阻断IGF信号可上调Tcf7l1的表达，同时抑制下游Nanog基因，并降低肝癌干细胞的自我更新能力，而且这种抑制作用在干扰Tcf7l1后能得到部分恢复。从而证明，Tcf7l1是IGF信号通路调控肝癌干细胞自我更新的一个重要分子。
5.阐明IGF信号通过MEK/ERK通路调控Tcf7l1磷酸化过程，并影响其蛋白稳定性
通过检测IGF信号抑制前后Tcf7l1mRNA和蛋白水平变化，发现IGF信号通路主要通过蛋白水平调控Tcf7l1的表达。机制上，IGF信号经由MEK/ERK通路提升Tcf7l1蛋白的磷酸化水平，进而Tcf7l1蛋白被泛素化降解。抑制IGF信号或使用ERK抑制剂可解除该调控作用。因此，本研究首次发现IGF信号通过MEK/ERK通路调控Tcf7l1蛋白磷酸化和泛素化降解。
6.证明IGF信号通路对Tcf7l1的调控不依赖于β-catenin
通过构建β-cateninCRISPR质粒，筛选出β-catenin基因敲除的肝癌细胞单克隆株。通过构建β-catenin基因敲除的肝癌细胞株检测IGF信号通路对Tcf7l1表达，证明β-catenin基因不影响IGF信号通路对Tcf7l1表达的调控，β-catenin基因的敲除也不影响Tcf7l1蛋白泛素化，从而证明IGF信号通路调控Tcf7l1的表达不依赖于β-catenin。
综上所述，本研究发现，不同于在其他类型肿瘤中的促瘤作用，Tcf7l1在肝癌中对肿瘤的起始和进展起抑制作用；Tcf7l1在肝癌中低表达，并且其表达水平与患者预后显著相关；在肝癌干细胞中，Tcf7l1通过转录抑制Nanog基因调控细胞的自我更新能力；更重要地，本研究发现IGF信号通过MEK/ERK通路调控Tcf7l1的磷酸化和泛素化降解，这是除Wnt/β-catenin信号通路调控Tcf7l1外的一种新调控途径。本研究丰富了Tcf7l1在肿瘤中的功能，对细胞外信号如何调控肝癌干细胞自我更新提供了新的理解，为开发针对肝癌干细胞治疗药物提供了理论支撑。