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本论文共由三个部分组成:(1)PDE5抑制剂sildenafil新的生物学功能研究；(2)糖尿病新靶点GPR40拮抗剂或DGAT1抑制剂体内对糖、脂代谢的研究；(3)建立B-raf抑制剂筛选模型。
Sildnenafil(西地那非)能够抑制cGMP降解,是第一个用于治疗勃起功能障碍和肺动脉高压的PDE5抑制剂。我们发现sildenafil显著促进了3T3L1前脂肪细胞分化和葡萄糖转运。另外两个临床使用的PDE5抑制剂(vardenafil、tadalafil)以及cGMP类似物8-pCPT-cGMP同样能够促进脂肪细胞分化。PKG抑制剂明显降低了sildenafil和8-pCPT-cGMP诱导的脂肪细胞分化。Sildenafil和8-pCPT-cGMP都能依次增加脂源性基因CEBPβ,CEBPα、PPARγ的表达,这些基因表达的上调同样能够被PKG抑制剂抑制。因此,sildenafil可能通过激活PKG,增加CEBPβ,CEBPα、PPARγ表达,从而促进脂肪细胞分化。
cGMP产生是UVB诱导的黑色素生成必需的,但是PDE5抑制剂是否能够促进黑色素生成还不清楚。我们发现sildenafil能像8-pCPT-cGMP一样促进CREB磷酸化、酪氨酸酶表达,最终导致黑色素合成增加。PKG抑制剂降低了sildenafil和8-pCPT-cGMP诱导的黑色素生成,但是对cAMP升高试剂IBMX诱导的CREB磷酸化、酪氨酸酶表达、黑色素生成却没有影响。而CREB磷酸化是黑色素生成限速酶-酪氨酸酶表达的重要调节者。因此,sildenafil可能通过PKG依赖的CREB磷酸化,促进黑色素生成。我们的结果提示PDE5抑制剂对于色素缺失紊乱性疾病(白斑病、白发等)的治疗可能是有益的。
GPR40高表达于胰腺β细胞,是FFAs(自由脂肪酸)受体,其可能介导了FFAs对β细胞的损伤,但是对于GPR40是否是2型糖尿病治疗靶点,GPR40拮抗剂是否可用于糖尿病的治疗,仍需进一步的研究。我们首次研究了小分子GPR40拮抗剂对遗传性肥胖Zucker大鼠糖、脂代谢的影响。DC260126是我们发现的一个选择性GPR40拮抗剂。大鼠腹腔注射给予6mg/kgDC260126治疗8周。DC260126尽管对Zucker大鼠体重、饮食、血脂、口服糖耐量没有明显影响,但是显著降低了胰岛素水平、提高了胰岛素耐量。我们的结果表明GPR40拮抗剂可能有益于2型糖尿病的治疗。
我们首次研究了DGAT1小分子抑制剂对糖尿病db/db小鼠的糖、脂代谢的影响。db/db小鼠口服灌胃给予DGAT1抑制剂H128(3mg/kg和10m/kg),治疗5周。H128能有效降低体重、血脂和脂肪肝,其作用机制可能是抑制小肠脂肪吸收和增加肝脂肪酸氧化,但是DGAT1抑制剂不能降低db/db小鼠血糖。我们的结果支持DGAT1是一个治疗肥胖、高脂、脂肪肝的有效靶点。
原癌基因B-raf在70％恶性黑色素瘤患者中,发生激活突变(90％是V600E),其是恶性黑色素瘤发生发展的一个重要因为。因此选择性的抑制B-rafV600E能够有效的治疗恶性黑色素瘤,并且毒副作用小。为了建立B-raf抑制剂筛选模型,我们用Bac-to-bac系统在st9昆虫细胞中,表达B-raf活性区域(433-726)。BAY43-9006是一个强的B-raf激酶抑制剂,作为我们模型的阳性药。检测结果表明BAY43-9006对B-raf的IC50约为100nM,与文献报道一致,说明我们建立的B-raf抑制剂筛选模型是成功的。我们下一步计划是点突变B-raf(V600E),同样用Bac-to-bac系统表达B-rafV600E蛋白,建立B-rafV600E抑制剂筛选模型。