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研究背景和目的:我国结肠癌的发病率近年呈明显上升趋势,在发达城市及地区,其发病率已上升至恶性肿瘤的第三位,在农村也上升至恶性肿瘤的第五位。全球范围来看,其发病率也是在逐年上升,结肠癌在全球恶性肿瘤发病率位于第三位,其中在美国,结肠癌发病率高居所有恶性肿瘤发病率的第4位,病死率则为第2位。WNT信号通路在胚胎发育及肿瘤的发生发展中起着重要作用,WNT/β-catenin信号通路异常激活在多种癌症中具有关键作用。在结肠癌中广泛存在WNT经典通路的异常激活和β-catenin蛋白在细胞核内聚集,而抑制WNT信号通路活性可以抑制结肠癌增殖。85%以上的结肠癌中存在APC基因的突变,该突变阻断β-catenin磷酸化降解,从而引起β-catenin的胞内聚集激活Wnt/β-catenin通路,进而诱导结肠癌的发生。WNT5A基因作为WNT家族中的重要成员之一,定位于染色体的3p14.2-p21.1区,包含5个外显子。启动子区定位于富甘油磷酰胆碱的区域,包含多个顺式作用元件,位于WNT5A转录起始位点上游的631个碱基对具有较强的启动子活性。同时,其编码的WNT5A参与生长和分化过程中的细胞间信号传递。WNT5A是WNT非经典途径中重要配体,该基因编码产生两种蛋白亚型WNT5A-long和WNT5A-short,这两种蛋白亚型通过介导不同的信号通路而产生截然相反作用:抑癌作用(WNT5A-long)或促癌作用(WNT5A-short)。WNT5A作为WNT/β-catenin信号通路的抑制蛋白,其启动子区通常在结肠癌中呈超甲基化。基于以上背景,本课题研究了WNT5A启动子区域高甲基化在评估结肠癌患者预后中的价值,并且在培养的结肠癌细胞中探讨其分子机制。本实验应用HCT116、HT29、SW620、HCT8、LoVo、SW480和Rko等多种结肠癌细胞株作为研究材料,用qRT-PCR检测WNT5A mRNA水平,用甲基化特异性的PCR(methylation-specific PCR,MSP)进行WNT5A启动子区域DNA甲基化水平测定,用MTT法测定5-FU对结肠癌细胞活力影响,并在以5-FU化疗作为一线治疗的结肠癌患者(n=126)中,进一步探讨了WNT5A启动子区甲基化与化疗药物反应及无进展存活率关系。方法:1.采用qRT-PCR检测7种结肠癌细胞WNT5A的mRNA水平,MSP检测其启动子区域DNA甲基化水平。DAC(5-Aza-2’-deoxycytidine,5-杂氮-2’脱氧胞苷)处理WNT5A低表达的HCT116和SW620细胞,qRT-PCR检测WNT5A mRNA水平。2.将低表达WNT5A的HCT116和SW620细胞经过转染WNT5A质粒使其高表达,将高表达WNT5A的Lovo、SW460细胞转染WNT5A-siRNA使其低表达;之后用5-FU处理,并用MTT法测定细胞增殖活力。3.收集郑州大学第一附属医院2000年至2001年结肠癌患者样本共126例,分析其WNT5A启动子区域甲基化水平与其临床病理特点(5-FU化疗效果及无进展存活时间)的关系。4.使用GrahpPad Prism 6统计软件进行数据分析,资料用均数±标准差(Mean±SD)表示,根据数据处理的不同方法及统计学处理的不同要求采用t检验,方差分析,Log rank检验;若方差不齐进行变量转换。检验标准α=0.05。结果:1.WNT5A启动子区甲基化水平影响其转录水平。首先在多种结肠癌细胞系中检测WNT5A的转录水平及其启动子区域甲基化水平,发现在LoVo,SW480,Rko细胞中,WNT5A启动子区呈低或无甲基化,其mRNA水平较高;在HCT116、HT29、SW620和HCT8细胞中WNT5A启动子区则呈完全或高甲基化状态,其mRNA水平较低。在WNT5A启动子区高甲基化的结肠癌细胞系(HCT116和SW620)中用DAC处理以抑制其WNT5A启动子区甲基化,发现WNT5A转录水平增强,表明WNT5A启动子区甲基化可影响其转录水平。2.在WNT5A启动子区高甲基化(WNT5A mRNA较低)的HCT116和SW620细胞中过表达WNT5A,发现过表达WNT5A废除了5-FU的肿瘤抑制作用;在WNT5A启动子区低甲基化(WNT5A mRNA较高)的LoVo和SW480细胞中降低WNT5A的表达,会增强5-FU的肿瘤抑制作用。3.在126例结肠癌患者样本中,WNT5A启动子区甲基化与肿瘤分期、组织分级、性别及年龄没有相关性。经5-FU治疗有效的结肠癌患者WNT5A启动子区甲基化水平明显高于5-FU治疗无效的结肠癌患者,WNT5A启动子区高甲基化患者较低甲基化患者有更长的无进展生存期。结论:1.在结肠癌中WNT5A的表达与其启动子区甲基化水平有关。2.WNT5A可影响结肠癌细胞对5-FU的敏感性,影响5-FU的肿瘤抑制作用。3.WNT5A启动子区甲基化与5-FU化疗效果和结肠癌患者预后相关,因此认为可能将其作为判断结肠癌预后及选择化疗的指标。