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中药雷公藤在临床广泛用于治疗风湿、红斑狼疮等自身免疫性疾病,具有良好的疗效。但在使用中雷公藤经常发生严重的肝肾等组织毒性反应,增加了用药的安全风险。雷公藤甲素被认为是雷公藤的重要活性物质,是其药效和毒性作用的重要物质基础。现有研究表明雷公藤甲素通过诱导T细胞凋亡和下调多种IL炎症因子两种途径实现其抗炎效果。对于其毒性作用的研究发现氧化应激和细胞凋亡可能是两大重要的毒性机理。然而,人们对于雷公藤甲素和雷公藤多苷制剂的药效利毒性作用过程和机制,仍有待系统深入的研究和认识。我们先前的研究发现雷公藤甲素可通过调节鞘脂的代谢来抑制迟发型超敏反应,我们推测鞘脂可能在雷公藤的治疗与毒性作用过程中发挥着重要的调节作用。为了进一步深入研究雷公藤甲素和雷公藤多苷制剂的治疗与毒性作用的内在机制,我们拟基于鞘脂代谢组学和转录组学,系统地研究雷公藤甲素和雷公藤多苷制剂对于靶器官中鞘脂代谢的影响,从鞘脂代谢角度揭示其药效和毒性作用机制,探索能够表征药效、预示毒性的潜在生物标志物,为临床疗效评价和安全用药提供依据。首先,我们以BalbC小鼠建立了迟发型超敏反应动物模型,并给予低、中、高三个剂量的雷公藤甲素以及两种不同厂家的雷公藤多苷片,为了评价其抗炎作用,以给药后小鼠的耳肿胀系数做为指标；此外,对血浆中表征肝肾功能的生化指标(ALT、AST、BUN)、肝脏和肾脏的氧化应激指标(SOD、MDA、GSH)进行了测定,同时肝脏和肾脏进行了病理学分析,综合评价雷公藤的肝肾毒性作用。结果显示,低剂量的雷公藤甲素和不同剂量的雷公藤多苷片对于迟发型超敏反应均有显著的抑制作用,而高剂量的雷公藤甲素不仅无明显的抑制作用,还引起肝脏的显著病理异常。高剂量的雷公藤多苷片可引起肝和肾的组织病理异常。此外,高剂量的雷公藤甲素和雷公藤多苷片都会引起肝脏和肾脏的生化指标和氧化应激的显著异常。其次,我们利用实验室已建立的HPLC-MS/MS鞘脂分析平台,将给予低、中、高三个剂量的雷公藤甲素以及两种不同厂家的雷公藤多苷片后,迟发型超敏反应BalbC小鼠不同组织(包括肝、肾、脾、胸腺)和血浆中的鞘脂水平进行测定,采用t-test和生物统计学方法,发现代谢异常的鞘脂,以及与雷公藤甲素及雷公藤多苷片药效和毒性作用相关的潜在生物标志物,结果显示雷公藤甲素的药效和毒性作用与鞘脂代谢紧密相关,并与给药剂量呈高度的相关性,雷公藤甲素不仅会影响鞘脂种类及亚类的水平,同时也改变了组织中不同碳链和不同不饱和度的鞘脂的比例组成。其中低剂量的雷公藤甲素可下调二氢神经酰胺(dhCer)、神经酰胺(Cer)和1-磷酸-神经酰胺(Cer-1-P)的水平,但高剂量的雷公藤甲素和雷公藤多苷片主要引起神经酰胺(Cer)、神经酰胆碱(SM)、神经鞘氨醇(Sph)的显著升高。同时雷公藤甲素和雷公藤多苷片还主要引起长链鞘脂(C16-C20)的比例显著升高,并影响不同饱和度的鞘脂的相对比例,低剂量和中剂量的雷公藤甲素主要引起组织中饱和HexCer的比例升高,高剂量的雷公藤甲素主要引起组织中饱和Cer的比例升高,低剂量的雷公藤多苷片主要引起组织中饱和dhCer和SM的比例降低,而高剂量的雷公藤多苷片主要导致组织中饱和Cer和HexCer的比例降低。此外,我们采用Spearman相关性分析以及偏最小二乘判别分析方法寻找表征雷公藤甲素和雷公藤多苷片的疗效和毒性的潜在标志物(与雷公藤甲素药效相关的标志物包括3种dhCer、4种Cer、3种HexCer、2种鞘氨醇类、1种Cer-1-P,与雷公藤甲素毒性作用相关的潜在标志物包括5种dhCer、6种Cer、7种HexCer、4种SM、1种鞘氨醇类；雷公藤多苷片疗效相关的潜在标志物包括5种dhCer、5种Cer、3种HexCer、5种SM、2种鞘氨醇类、1种Cer-1-P,与雷公藤多苷片的毒性作用相关的潜在生物标志物包括6种dhCer、7种Cer、9种HexCer、8种SM、3种鞘氨醇类、1种Cer-1-P。)。在鞘脂组学研究的基础上,我们采用荧光定量PCR方法测定了肝肾中鞘脂合成代谢相关的29种酶的mRNA转录水平,结果显示雷公藤多苷片能够导致多利,关键的鞘脂代谢酶的转录水平发生明显的变化,包括肝中CerS1、Smpd1、2、 Asah1、2、肾脏中Degs1、Smpd1、2、Asah1、2以及脾脏中的Smpd1、2。此外,组织中6种神经酰胺合成酶CerS的转录水平变化存在显著的差异,引起组织中不同长度碳链鞘脂的比例变化的存在差异。对于鞘脂合成代谢酶的转录水平分析,帮助我们对雷公藤多苷片调控鞘脂及其亚类的代谢变化和机制有了更深入的了解,包括鞘脂代谢酶mRNA表达水平的变化、相应的不同类型鞘脂含量的变化和不同碳链长度鞘脂分布的变化。另一方面,这些结果也帮助我们找到在雷公藤甲素药效和毒性作用过程中关键的鞘脂合成代谢酶；将为雷公藤的减毒增效研究提供了重要的信息,从而降低雷公藤临床使用风险。生物统计学分析发现的重要生物标志物和鞘脂代谢酶与雷公藤甲素和雷公藤多苷片的药效作用和毒性作用密切相关。总之,雷公藤甲素及雷公藤多苷片可引起鞘脂代谢的显著变化,这可能是其药效和肝肾毒性作用的重要分子机制,发现的重要生物标志物可作为雷公藤疗效和毒性作用评价的潜在指标。同时,关键代谢酶也是雷公藤药效作用和毒性作用的重要靶点。再次,为了了解雷公藤甲素和雷公藤多苷片引起迟发型超敏反应BalbC小鼠体内鞘脂代谢变化的物质基础,从代谢角度揭示其药效和毒性作用,我们研究了雷公藤甲素和多苷片在迟发型超敏反应BalbC小鼠体内的代谢产物。首先,我们对雷公藤多苷片的成分进行了分析,以了解其详细的成分组成和.含量信息。由于雷公藤的成分复杂,且多种成分化学结构相近,色谱分离困难,我们建立了具有高峰容量高选择性的全二维液相色谱联用四级杆飞行时间质谱的分析方法,对雷公藤多苷片的化学成分进行分离分析,以甲醇为溶剂提取雷公藤多苷片的化学成分,采用全二维色谱模式进行色谱分离,其中第一维色谱采用C8色谱柱,流动相为水和甲醇,进行梯度洗脱：第二维采用C18色谱柱,流动相为水(含0.1%甲酸)和乙腈(含0.08%甲酸),第二维色谱采用固定梯度和从动梯度相结合的梯度模式。质谱检测采用ESI离子源,正离子检测模式,质谱扫描范围：100-1000 m/z,获得化合物的的一级和二级高分辨质谱信息,根据质谱信息对化学成分进行结构鉴定,结合文献报道,我们从湖北黄石与湖南协力生产的两种雷公藤多苷片中分别初步鉴定了92种和132种化合物,这些化合物主要为二萜类、三萜类和生物碱类成分,两种厂家的雷公藤多苷片中存在42种共有成分,两种厂家的雷公藤多苷片成分差异较大。将成分的提取离子流色谱图进行积分,以峰面积归一化方法计算各成分的相对含量,42种共有成分的峰面积分别占湖北黄石和湖南协力制剂的总峰面积的48.0%和45.8%,两种制剂的共有成分的含量存在差异。与一维色谱分析方法相比,本研究建立的全二维液相色谱飞行时间质谱联用分析方法具有更高的峰容量和分离效率,可有效排除一维色谱各成分之间的相互干扰,获得更好的分离效果。全二维液相色谱四级杆飞行时间质谱联用的分析方法为发现和鉴定雷公藤多苷片中的化学成分提供了一种快速、高效、灵敏的手段,为雷公藤多苷片的药效评价和毒理研究提供了重要的信息。本研究揭示了两种雷公藤多苷片在成分种类和含量上的差异,从而帮助我们从物质基础的角度来解释两种厂家雷公藤制剂在毒性和药效作用上的差异。最后在获得雷公藤多苷片成分信息的基础上,采用高效液相色谱四极杆串联飞行时间质谱技术(HPLC-QTOF-MS)分析了雷公藤甲素和雷公藤多苷片在肝肾组织中的代谢产物。采用SPE方法对样品进行前处理。色谱分析采用Restek Ultra.AQC18柱,流动相为水(含有2mM乙酸铵和0.05%甲酸)和乙腈(含有0.05%甲酸),采用梯度洗脱,流速为0.4 mL/min。质谱采用ESI离子源,正离子模式,质量扫描范围m/z 100-1000。首先采用体外肝微粒孵化的方法获得了雷公藤甲素的6种谷胱甘肽结合代谢产物的液相和质谱信息,在此基础上分析了正常与迟发型超敏反应模型状态下和不同剂量情况下,小鼠体内肝肾组织和血浆中雷公藤甲素的代谢产物谱以及主要代谢产物随时间的变化趋势。结果显示雷公藤甲素在小鼠体内主要发生羟基化、脱氢、水解、水解+羟基化、脱氢+羟基化等I相代谢,然后雷公藤甲素及其I相代谢产物又会进一步结合Cys、GSH、Glu生成II相代谢产物。肝脏是雷公藤甲素在体内的主要代谢器官,共检测到了45种代谢产物,特别是检测到了14种与Cys和GSH结合的活性代谢产物。在肾脏和血浆中也分别检测到了1种和3种Cys和GSH结合代谢产物。GSH和Cys结合是雷公藤甲素体内的重要代谢反应,该代谢反应可能与雷公藤甲素的肝肾毒性作用相关。雷公藤甲素在小鼠体内经历快速的代谢和消除过程,在10mmin和30min,代谢物种类最多,30min后其数量显著降低。采用高效液相色谱四极杆串联飞行时间质谱技术(HPLC-QTOF-MS)进一步分析雷公藤多苷片给药后在肝脏和肾脏中的主要成分及其代谢物,结果在肝脏和肾脏中分别检测到42种和32种原型成分,包括二萜类、三萜类和生物碱类成分。在肝脏和肾脏中各检测到58种和45种相关代谢产物。检测到的这些成分以及相应的代谢产物为雷公藤多苷有效成分和毒性成分研究奠定了重要的基础。此外,这些分析结果为雷公藤多苷片的临床安全用药和制剂质量控制提供重要的信息。