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研究背景高级别胶质瘤是最常见、具有高度增殖和侵袭性的颅内肿瘤,具有难治性、易局部播散和易复发等特点,预后极差,生存期短,如胶质母细胞瘤,中位生存期14.6-16个月,5年生存率仅为3.4%。胶质瘤的治疗需要结合手术切除、化疗、放疗和基于肿瘤的组织学和分子特征的靶向治疗。胶质瘤的分子靶向药物是根据脑胶质瘤发生及生长的分子遗传学信号系统所设计,可以靶向特异靶点,阻断肿瘤的生长,可以明显提高患者无瘤生存期。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)系统是高级别胶质细胞瘤靶向治疗的一个最有吸引力的靶点,高级别脑胶质瘤肿瘤微环境中特别是低氧、炎症因子以及炎症相关细胞聚集,使得VEGF表达量上调,周围存在高水平VEGF-A,通过旁分泌机制促进内皮细胞的增殖、存活和迁移。这导致了脉管系统的紊乱与血脑屏障损伤,VEGF过表达与血管密度、肿瘤分级和总体预后成正比。贝伐单抗具备高亲和力且特异性地结合VEGF-A,是目前神经系统高级别肿瘤最常用的分子靶向药物,可有效的抑制新生血管生成,对肿瘤的生长起到明显的治疗效果。自2009美国食品和药物管理局批准贝伐单抗进入临床起,大量临床研究表明贝伐单抗对高级别胶质瘤症状有显著改善,6个月无进展生存率提高。尤其是紧急的情况下,贝伐单抗治疗对于在标准治疗期间进展迅速的胶质瘤患者是一种挽救性治疗选择。贝伐单抗已越来越多地用于复发性胶质母细胞瘤的治疗。然而,贝伐单抗的作用是短暂的,大部分高级别胶质瘤在6个月以后复发甚至进展了,复发时远处或弥漫性疾病的发病率增加,向更具攻击性的表型转变。贝伐单抗治疗失败的机制是复杂的,包括:胶质母细胞瘤是一种高度浸润性肿瘤,不可能全部切除;肿瘤异质性导致药物的敏感性不同;抗VEGF导致的肿瘤转移性增强等。肿瘤可能会选择性上调某些血管生成途径。当VEGF信号途径被阻断时,其他信号转导途径也可以刺激血管生长。因此,明确胶质瘤患者VEGF信号途径中其他蛋白的表达情况,多靶点的联合免疫疗法或许会让贝伐单抗治疗的患者更受益。microRNA参与血管生成途径,在控制血管生成中的作用被公认为是癌症和心血管疾病的一个有前途的治疗靶点。外泌体(exosomes)是细胞分泌的有双层脂质膜的囊泡,是细胞之间生命活动物质交换的一种重要工具,其内含有蛋白质和核酸(主要为miRNA)等物质,具有特异性、稳定性、易获取性和能穿过血脑屏障等特点,基于高通量测序技术的及生物信息学分析可筛选血清外泌体中与颅内肿瘤发生、发展相关循环核酸分子,并预测血管生成相关的mmiRNA,有望成为颅内肿瘤的治疗的作用靶点。另外,术前胶质瘤的鉴别诊断(例如与颅内原发淋巴瘤的鉴别)也是困扰临床的难题。准确的诊断有利于制定治疗方案,对患者生存期的延长有决定性作用。目前,其诊断的“金标准”依然是组织学病理活检,但病理学标本的获取存在很大障碍。基于高通量测序技术筛选的差异miRNA有望成为胶质瘤诊断的高敏感度和特异度的生物标志物。第一部分 VEGF信号通路中胶质瘤的抗血管生成和抗淋巴管生成治疗新靶点的研究目的:贝伐单抗是主要针对VEGF-A起作用的,而评估有效的生物标记物联合治疗可能会让贝伐单抗治疗的患者更受益。本研究拟评估VEGF信号系统的VEGF-C和VEGF-D与VEGFR-3在胶质瘤中的表达,为胶质瘤的抗血管生成和抗淋巴管生成治疗提供新靶点。方法:本研究选择121例在2011年6月至2015年2月期间在山东大学第二医院和齐鲁医院神经外科住院诊断为胶质瘤并手术治疗的患者。通过对胶质瘤病人的肿瘤组织及正常对照进行组织化学染色,研究血管生成和淋巴管生成相关标志物VEGF-C,VEGF-D,VEGFR-3和D2-40的表达情况,统计病人基本临床资料和P53,Ki67等病理结果。采用非参数Spearman相关分析病理分级与D2-40、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3、p53和Ki67表达水平的关系。非参数Spearman相关分析评估第一次术后无病生存时间与不同标记物表达之间的关系。用Wilcoxon matched pairs signed rank对初诊和复发的标志物表达水平进行分析。采用Cox比例风险回归模型对胶质瘤进行多因素预后分析。结果:1.101例胶质瘤病人的结果病人的年龄的中位数是40.5岁,最常见的临床症状是头痛,呕吐,肢体瘫痪,癫痫和昏迷。肿瘤的平均大小为4.1±1.6cm。101例病人中,WHO分级Ⅰ级18例,Ⅱ级25例,Ⅲ级24例,Ⅳ级34例。胶质瘤病人的P53和Ki67的表达与肿瘤的分级相关(P<0.001,P<O.001)。P53与Ki67有相关性(P=0.0005)。不同的WHO分级的病人的年龄也有显著差异(P=0.0005)。101例胶质瘤标本中D2-40,VEGF-C,VEGF-D 和 VEGFR-3 的阳性率分别为 27.7%,34.7%,87.1%和 24.7%。D2-40和VEGFR3与肿瘤的分级相关,恶性程度高的Ⅳ级胶质瘤具有更高的D2-40(P =0.047)和 VEGFR3(P =0.040)的表达。但是,VEGF-C 与 VEGF-D 没有显著的差异(P=0.38,P=0.081)。2.20例胶质瘤病人初发和复发的结果本研究中有20例胶质瘤病人是在接受手术治疗后复发并进行了第二次手术。病人的年龄的中位数是43.5岁,术后无进展生存期为1.65±1.35年。最常见的临床症状是头痛,肢体瘫痪,癫痫。肿瘤的平均大小为4.3±1.7cm。20例病人在初次术后诊断时按照WHO分级,Ⅰ级有1例,Ⅱ级6例,Ⅲ级9例,ⅣV级4例。复发后术后病理结果Ⅱ级2例,Ⅲ级2例,Ⅳ级16例。复发后有65%(13/20)的病人肿瘤等级进展了。免疫组织化学染色结果显示在肿瘤组织临近的正常脑组织中没有D2-40、VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3的表达。D2-40、VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3在原发性胶质瘤中的阳性率为20%、30%、60%和20%,在复发性胶质瘤中的阳性率为 45%、30%、75%和 35%(P<0.01,P=1.00,P=0.03,P=0.03)。术后的无进展生存期与 D2-40(P=0.78)、VEGF-C(P=0.64)、VEGF-D(P=0.11)、VEGFR-3(P=0.31)、Ki67(P=0.69)和 p53(P=0.35)的表达无关。20 例病人中有 6例病人的淋巴管标志物(D2-40、VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3)均为阴性,他们与其余14人的无进展生存期时间无显著差异(P=1.665)。胶质瘤的病理分级与 D2-40(P=0.0060)、VEGF-D(P=0.017)、VEGFR-3(P=0.032)、Ki67(P<0.001)和p53(P=0.003)显著相关,与VEGF-C的表达无显著相关(P=0.059)。20例病人中有 13 例在复发时 Ki67、p53、D2-40、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3 表达水平升高。Ki67和p53在复发时显著高于初发肿瘤(Ki67,P=0.001,10(5-27.5)%VS 40(35-55)%,p53,P=0.045,10(0-25)%VS 25(17.5-37.5)%)。D2-40和VEGF-D的表达在复发与原发肿瘤之间也有显著性差异(P=0.031,P=0.047),而VEGF-C和VEGFR-3的表达无显著差异(P=0.094,p=0.25)。包括D2-40、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3、Ki67、p53、原发肿瘤分级和复发肿瘤分级的多因素生存分析显示VEGF-D是胶质瘤的独立预后因子(HR=0.376,P=0.045)。结论:恶性程度高的胶质瘤的组织中D2-40,VEGD-D和VEGFR3表达高,胶质瘤复发时常伴有WHO分级的进展,VEGF-D是胶质瘤的独立预后因子,其有望成为胶质瘤治疗的新靶点,联合治疗让贝伐单抗治疗的患者更受益。第二部分 基于高通量测序技术的血清外泌体差异miRNA在胶质瘤的特异性诊断和治疗中的应用目的:目前,没有用于高级别胶质瘤与颅内淋巴瘤鉴别诊断的有效的无创的方法,本研究拟用高通量测序技术筛选血清外泌体中的microRNA标志物,用于高级别胶质瘤和颅内淋巴瘤的鉴别诊断,并基于生物信息学分析结果筛选用于高级别胶质瘤和颅内淋巴瘤的抗血管生成治疗的新靶点。方法:研究首先通过HiSeq/MiSeq高通量测序技术测定颅内淋巴瘤患者,高级别胶质瘤患者和健康对照者血清外泌体中的游离mmicroRNA表达谱,筛选出颅内淋巴瘤患者,高级别胶质瘤患者差异表达的候选microRNA。分离12例颅内淋巴瘤患者、32例高级别胶质瘤患者和20例健康对照者血清外泌体,采用RT-qPCR验证候选microRNA的表达。小样本评估候选microRNA对颅内淋巴瘤和高级别胶质瘤的诊断价值。然后,从颅内淋巴瘤患者和高级别胶质瘤患者血清外泌体microRNA表达谱中选择二者共有的涉及血管生成和淋巴管生成的候选microRNA,通过 RT-qPCR 验证候选 microRNA 的表达。采用 Kolmogorov-Smirnov检测数据的分布状态,Micro-RNA在组间的表达水平差异用Mann-Whitney U检验或Kruskal-Wallis检验。应用受试工作者曲线对诊断价值进行分析。结果:本次测序筛选到高级别胶质瘤血清外泌体与正常对照之间的差异miRNA个数为100个,颅内淋巴瘤血清外泌体与正常对照之间的差异miRNA个数为186个,颅内淋巴瘤血清外泌体与高级别胶质瘤血清外泌体之间的差异miRNA个数为140个。将高级别胶质瘤血清外泌体与正常对照血清外泌体之间的差异miRNA和高级别胶质瘤血清外泌体与正常对照血清外泌体之间的差异miRNA的个数进行统计筛选到血清外泌体中存在的淋巴瘤和胶质瘤共同的与正常对照有差异的miRNA 的个数为 44 个,上调的有 miR-20b-5p,mmiR-96-5p,miR-550a-3-5p 和miR-550a-5p等,下调的有miR-203a-3p,miR-203b-5p,miR 1255a,miR-1296-5p,miR-6516-5p和miR-376b-5p等。筛选到血清外泌体中存在的胶质瘤的特有的与正常对照有差异的miRNA的个数为56个,miR-375,miR-532-3p,miR-30c-1-3p,miR-23b-5p,miR-330-5p 和 miR-3074-3p 等。聚类分析显示高级别胶质瘤病人血清外泌体中存在的较颅内淋巴瘤病人和正常对照相比56个特异性miRNA表达谱。KEGG途径富集分析列出了参与胶质瘤调节的20条显著富集的途径。,涉及到与生理和病理血管生成相关的Focal adhesion,Proteoglycans in cancer和Pathways in cancer等通路。miR-376b-5p验证其可否作为颅内淋巴瘤和高级别胶质瘤的共同的抗血管生成的治疗靶点。在小样本的12例颅内淋巴瘤患者、32例高级别胶质瘤患者和20例健康对照者血清外泌体microRNA的验证中,miR-532-3p在颅内淋巴瘤中下调(P=0.02),在高级别胶质瘤中上调(P<0.001),miR-376b-5p在淋巴瘤和胶质瘤中都下调(P=0.02,P=0.04)。miR-532-3p 对胶质瘤的诊断的 AUC 为 0.8203(P<0.001)。结论:miR-532-3p可作为高级别胶质瘤和颅内淋巴瘤的鉴别诊断的标志物,miR-376b-5p有望成为颅内淋巴瘤和高级别胶质瘤的抗血管生成治疗新靶点。