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前 言移植心脏冠状血管病变 (Transplant Coronary Artery Disease TCAD)是心脏移植术后远期的重要并发症,近年来,随着新的免疫抑制剂的应用,心脏移植的近期生存率不断提高,但远期的血管病变的发生率并未下降,根据冠脉造影,移植术后1年,2年,4年的冠脉病变的发生率分别是11%,22%,45%。由于心脏移植后去神经,TCAD发生时患者没有心绞痛症状,患病早期不易发现,加之病变呈弥漫性的改变,它包括冠状动脉,静脉及毛细血管均受累,一旦出现TCAD,传统治疗手段如PTCA,冠脉搭桥效果差,TCAD的死亡率高达25%,已经成为心脏移植远期死亡的主要原因。预防与治疗TCAD仍然是心脏移植工作者面临迫切需要解决的课题。TCAD的确切发病机制尚不明确,可能是免疫因素与非免疫因素共同作用造成。在病变的前期,主要是血管内皮功能的损害。内皮细胞损害造成导致炎症细胞附壁,浸润,血小板聚集,释放各种细胞因子,促使平滑肌细胞增殖,新内膜增厚。虽然免疫反应的触发有抗原针对性,但随后的一系列反应却是非特异性的炎症反应。内皮素ET-1是一种含21个氨基酸的多肽,最早是从内皮细胞提取出来,是一种很强收缩血管因子,后来发现平滑肌细胞SMC,巨噬细胞,纤维细胞等也是ET-1的重要来源。ET-1除缩血管作用之外,还有其他广泛的生理功能和病理作用。ET-1能促进各种细胞因子和生长因子的产生如内皮生长因子,碱性纤维生长因子等。ET-1还能促进PDGF和bFGF的分泌放大它们的生物效应,ET-1还能促进中性粒细胞的粘附和血小板的聚集。ET-1的这些作用主要是通过内皮素受体实现的,因此ET-1和内皮素受体ETA成为心血管病治疗的新的靶点。ET-1在移植血管病变的血管中的表达明显增强,与移植血管的内膜增殖密切相关,但ETA与TCAD的关系研究未见报道,本文课题通过建立同种异体的大鼠颈动脉血管移植模型,观察ET-1及其受体ETA在移植血管<WP=5>中的表达,阐明ET-1及其受体在TCAD的病理机制中的作用,同时利用反义核苷酸技术,将ETA的反义核苷酸转染给供体血管,观察ETA的反义核苷酸对移植血管内膜增殖的抑制作用,并对其机制进行初步探讨,为将来的临床的应用提供理论基础。现将本课题的内容简要介绍如下:第一部分 移植血管病变动物模型的建立目的:建立同种异体血管移植的动物模型。方法:以Wistar大鼠的颈动脉为供体血管,利用显微外科技术,将Wistar大鼠的颈动脉移植给SD大鼠,以SD大鼠对SD大鼠同基因移植为对照,移植后1,2, 4,和6周,摘取移植血管,观察同种异体血管移植的病理变化过程。结果:移植血管的通畅率达100%,移植后的第一周其主要的病理改变是内皮功能的损害,随后是中层SMC增殖,移植血管的内膜增殖开始于移植后第二周,移植血管病变在移植4周后基本形成,移植后6周,内膜增厚凸向管腔,导致管腔的明显狭窄甚至闭塞。电镜下观察,同种异体血管移植1周,内皮细胞损害,2周后SMC细胞由收缩型向合成型转变,移植4周,新生内膜层形成。增厚的新内膜由分化的SMC和丰富的细胞基质组成。结论:Wistar和SD大鼠间的血管移植是符合同种异体移植血管的病理改变,可以用于移植血管病变的病理机制及干预治疗的研究。 第二部分 ET-1及其受体ETA,ETB在移植血管中的表达目的:阐明ET-1及其受体ETA,ETB在TCAD病理机制中的作用。方法:以Wistar和SD大鼠间的血管移植为动物模型,利用放免法测定移植后不同时间血管组织ET-1含量,应用免疫组化技术观察ET-1及其受体ETA.,ETB在移植血管组织各层的表达,以内膜增殖指数(内膜面积与中层面积的比值)作为因变量,以移植血管的ET-1及其受体ETA.,ETB的表达强度为自变量,通过直线相关分析,观察ET-1及其受体ETAETB在移植血管组织各层的表达与移植血管内膜增殖的关系。结果:移植血管组织ET-1的含量随时间变化逐渐增加。 免疫组化显示移植1周,中层ET-1的表达增强,移植2周这表达继续增强,移植4周在中层及增生的内膜层ET-1及ETA的表达强度与血管的内膜增殖程度成正相关,与内膜层的ETB的表达负相关。结论:ET-1及其受体ETA在TCAD病理<WP=6>机制中具有特别重要的作用,ET-1及ETA受体是防治TCAD的重要靶目标。第三部分 内皮素受体A反义寡聚核苷酸(AS-ETA-ODN)对移植血管内膜增殖的抑制作用目的:观察ETA受体反义核苷酸(AS-ETA-ODN)对移植血管内膜增殖的抑制作用及机制探讨。方法:利用高压技术,在体外将硫代ETA受体反义核苷酸转染给供体血管,在移植后的1周2周4周,摘取移植血管,利用免疫组化观察PCNA在移植血管的表达,利用RT-PCR,观察ETA的mRNA和PDGF,bFGF,iNOS的mRNA在移植血管组织中的表达,同时测定移植血管组织的MDA,MPO 及NO的含量及移植血管内膜增殖程度。结果:高压能提高ETA的在血管组织细胞中的转染率,免疫组织化学显示ETA受体反义核苷酸能抑制移植血管组织中PCNA 和ETA表达,RT-PCR表明AS -ETA-ODN明显抑制ETAmRNA的表达,也能抑制PDGF,FGF的表达,对iNOS的表达无明显影响,治疗组移植早期血管组织中MDA 和MPO的含量明显减少,而移植后期NO含量增加,治疗组的移植血管的内膜增殖程度明显低于对照组。结论:AS-ETA ODN对移植血管病变具有抑制作用,其机制与减少PDGF,bFGF的生成,抑制SMC的增殖有关,也与其抑制炎症细胞浸润,减少 MDA及MPO释放,保护NO有