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目的食管癌位于全球癌症死亡率中第六,其中,我国的中北部是食管癌高发地区之一。90%以上的食管癌类型为鳞癌,虽然肿瘤的治疗技术在不断地提高,但食管鳞癌的五年生存率仍低于30%。食管鳞癌的发病原因多种多样,它的发生机制也是错综复杂,有许多研究发现它与多种信号通路的激活有关,但其具体的机制现在尚未研究清楚。近年来研究表明,肿瘤的发生与慢性感染和炎症有密切关系。因此,研究学者通过不断寻求设计新的方法了解食管鳞癌的分子机制,从而提高其临床治疗效果和预后,以及改善耐药性。目前,肿瘤的治疗方法包括手术、化疗、放射治疗以及生物治疗,可是这几种方法都存在一定的局限性,随着人们对肿瘤病因以及发病机制的不断深入了解,许多学者发现肿瘤是可以预防的。目前,化学预防在肿瘤中的应用逐渐受到广泛的关注,它是指利用天然的或者合成的药物提前干预肿瘤的进展,并且化学预防手段可以阻断肿瘤中多个信号通路的激活。姜黄素(Curcumin)是姜黄科植物根茎中的天然提取物,它不仅具有抗氧化、抗炎的功效,还能够调节NF-κB、MAPK等信号通路,从而抑制肿瘤细胞的增殖和促进肿瘤细胞的凋亡。近年来,有许多研究发现JAK-STAT信号通路在多种肿瘤中扮演着重要角色,STATs可以被多种细胞因子、生长因子和一些激素所激活,STAT3属于STATs蛋白家族中的一员。在正常细胞中,STAT3的激活是短暂且可逆的,目前,已有许多研究发现,在许多恶性肿瘤中检测到STAT3的持续激活,活化的STAT3可以促进肿瘤细胞的增殖、转移和血管生成,干扰肿瘤细胞凋亡和抗肿瘤免疫反应,也与肿瘤的预后有关等。因此,阻断STAT3的功能有望为肿瘤靶向治疗和化学预防提供一个新的重要方向。本文通过两部分来研究姜黄素在炎症诱导的食管鳞癌中的化学预防作用,利用si RNA下调食管鳞癌细胞中STAT3的表达,探究STAT3在食管鳞癌细胞生长中的作用,体外选取EC9706和TE13食管鳞癌细胞系为实验对象,评价姜黄素能否通过STAT3信号通路对食管鳞癌细胞的增殖、克隆形成能力、凋亡及周期产生影响;IL-6是STAT3的一个激活因子,我们用IL-6作用于EC9706和TE13细胞并联合应用姜黄素,评价姜黄素是否可以阻断因IL-6刺激以后的STAT3的组成型激活;体内建立人源性食管鳞癌移植瘤模型(PDX模型),评价姜黄素在体内对STAT3不同激活状态的肿瘤的治疗效果,为STAT3作为食管鳞癌的分子治疗靶点,以及姜黄素能否成为炎症诱导的食管鳞癌的化学预防药物提供理论依据。第一部分姜黄素通过下调STAT3的活性从而抑制食管鳞癌细胞的增殖及促进凋亡方法1.利用STAT3 si RNA作用于EC9706细胞48h,检测下调STAT3后细胞周期及凋亡情况。2.CCK-8细胞毒性实验:不同浓度姜黄素(0、25、50、100μM)分别作用于食管鳞癌细胞EC9706和TE13 24和48h,测定食管鳞细胞的吸光度值,从而计算出细胞的生存率,选取细胞生存率为80%左右的药物浓度为细胞增殖实验的最大药物浓度。3.CCK-8细胞增殖实验:不同浓度姜黄素(0、4、8、12、16μM)分别作用于食管鳞癌细胞EC9706和TE13不同时间(0、24、48、72、96h),测定食管鳞癌细胞在姜黄素作用下的吸光度值,评价姜黄素对细胞增殖能力的影响。4.软琼脂克隆形成实验:评价不同浓度姜黄素(0、4、8、12、16μM)对食管鳞癌细胞克隆形成能力的影响。5.细胞凋亡和周期实验:用Annexin V-FITC、Hoechst33342及DAPI染色,检测不同浓度姜黄素(0、4、8、12、16μM)对食管鳞癌细胞EC9706和TE13凋亡及周期的影响6.Western blotting检测姜黄素作用于食管鳞癌细胞EC9706和TE13后STAT3信号通路的变化;同样,利用该方法检测姜黄素对IL-6刺激EC9706和TE13细胞后STAT3信号通路的影响。结果1.结果显示,si RNA-1878和si RNA-1272转染EC9706细胞后,与对照组相比,凋亡的细胞以及S期细胞明显增多。2.不同浓度姜黄素(0、25、50、100μM)分别作用于EC9706和TE13细胞24、48h后,绘制细胞毒性结果曲线图,结果显示,细胞生存率为80%左右的药物浓度为20μM。3.不同浓度姜黄素(0、4、8、12、16μM)分别作用于EC9706和TE13细胞0、24、48、72、96h后,结果显示,姜黄素能够抑制食管鳞癌细胞的增殖,且浓度越大,细胞增殖的能力越小。4.软琼脂克隆形成实验结果表明,姜黄素可以抑制EC9706细胞的克隆形成,且姜黄素浓度越大,克隆数量越少。5.细胞凋亡和周期结果显示,姜黄素可以诱导EC9706和TE13细胞的凋亡,浓度越高,诱导作用越明显;姜黄素可以阻滞细胞周期的进展,使S期细胞数量明显增多,呈浓度依赖性。6.Western blotting结果显示,姜黄素可以抑制EC9706和TE13细胞中p-STAT3的表达,同时还能够抑制i NOS和p-NF-κB的表达,同时,姜黄素也可以抑制由IL-6引起的p-STAT3的活化。第二部分姜黄素通过下调STAT3的活性从而抑制人源性食管鳞癌移植瘤(PDX)的生长方法1.选取多种人食管鳞癌组织,提取蛋白后用Western blotting检测其p-STAT3的表达情况。2.选取组织EG37(p-STAT3高表达)和EG2(p-STAT3低表达),构建PDX模型,利用该模型评价姜黄素的抗癌和预防效果。3.治疗结束后,将各组瘤体剥出,提取蛋白后用Western blotting检测瘤体中p-STAT3及其调节的相关蛋白的表达情况。4.采用免疫组织化学法检测各组瘤体中STAT3信号通路以及Caspase-3的表达水平。5.用HE染色观察各组瘤体中细胞的分化、坏死情况。6.TUNEL法观察经姜黄素治疗后,组织细胞的凋亡情况。结果1.在EG37和EG2 PDX模型中,与对照组相比,姜黄素可以抑制肿瘤的生长,预防组比治疗组的抑制效果更加明显,且在这两个模型中,姜黄素的抗癌效果在STAT3高活化EG37组中更加显著。2.Western blotting结果显示,在姜黄素治疗组和预防组中,p-STAT3、i NOS、p-NF-κB和Cox2的表达水平降低。3.免疫组化结果显示,姜黄素治疗组和预防组中,p-STAT3和Cox2的表达水平降低,且Caspase-3的表达水平升高。4.TUNEL结果显示,在姜黄素治疗组和预防组中,瘤体组织细胞的凋亡数量明显增多。结论1.体外研究表明,姜黄素能够阻断食管鳞癌细胞中STAT3的活化,抑制IL-6激活的STAT3,以及下调p-NF-κB和i NOS的表达,从而抑制细胞的增殖、克隆形成,诱导细胞凋亡和阻滞细胞周期。2.人食管鳞癌PDX模型体内结果显示,姜黄素通过阻断STAT3的组成型激活从而抑制肿瘤的生长,且可以促进细胞的凋亡。3.体内外实验结果表明,姜黄素有望成为炎症诱导的食管鳞癌化学预防中的一种有效药物。