蓝细菌光敏色素的光化学性质与Slr0351功能的研究

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光敏色素是存在于植物和细菌中的感受光的功能色素蛋白,在植物的光形态发生和细菌的趋光性运动中发挥重要作用。蓝细菌光敏色素辅基蛋白通过IN末端GAF结构域中的半胱氨酸与藻胆色素(PCB)共价结合形成完整的有生理活性的光敏色素,蓝细菌中存在的光敏色素称为蓝细菌光敏色素(CBCRs)。根据Nostoc sp. PCC7120的基因组信息,我们获得了50多个CBCRs的GAF结构域。利用蛋白质聚类工具分析这些GAF结构域,发现一个DXCF光受体分支,该分支包含A111688、A112239、A111280GAF2、A113691GAF2、Alr1966GAF2、Alr2279、 Alr3356、Alr3120GAF1、Alr3120GAF2和Alr5272GAF1.利用分子生物学技术,将这些DXCF光受体分别与PCB在E. coli BL21中共表达,得到了8个能与色素共价结合的DXCF CBCRs,其中,仅Alr3120GAF1没有可逆光效应,其余7个DXCF CBCRs A111688、A111280GAF2、A112239、A113691GAF2、Alr1966GAF2、Alr2279和Alr3356均表现出不同的可逆光效应。这7个CBCRs的15Z态在410-430nm有吸收峰,而15E态在490-600nm的长波范围有吸收峰,由于其15Z态在蓝光区有吸收峰而称之为蓝光光受体。根据CBCRs结合色素的类型,将8个DXCF CBCRs分为3种类型:(1)结合PCB/TPcR的DXCF CBCRs,包括A111688、A112239、Alr3356和Alr3120GAF1;(2)结合PVB/TPvR的DXCF CBCRs, A113691GAF2属于这种类型;(3)结合PCB/TPcR与PVB/TPvR混合色素的DXCF CBCRs,包括A111280GAF2、A113691GAF2和Alr1966GAF2。通过定点诱变技术,研究了结合藻胆色素的保守性半胱氨酸Cc和Cx的功能。将DXCF CBCRs中的Cc突变后,A112239(C82L)、A113691GAF2(C87I)和Alr2279(C100I)在可见光区没有吸收峰,未能结合色素,而A111280GAF2(C81A)和Alr1966GAF2(C84A)在可见光区仅有微弱的吸收峰,与野生型相比大大降低,由此表明Cc在DXCF CBCRs的色素稳定结合中起重要作用。在DXCF CBCRs中,还存在另一个结合色素的保守性半胱氨酸Cx, Cx位于CBCRs的DXCF基序中,该Cys与藻胆色素形成第二个结合色素的硫醚键,第二个硫醚键的形成中断了藻胆色素的共轭体系,从而形成了类胆红素TPcR或TPvR, TPcR或TPvR赋予DXCF CBCRs在蓝光区的吸收峰。定点突变DXCF CBCRs的Cx后,所有Cx突变体在420nm附近的吸收峰消失,在560-650nm范围内的吸收峰升高,蓝光区吸收峰的消失表明TPcR或TPvR的形成受到抑制,从而确证了Cx与色素的C-10共价结合。扫描DXCF CBCRs的荧光光谱,6个具有可逆光吸收效应DXCF CBCRs均在630-660nm范围内有红色荧光发射峰,其荧光发射光谱在15Z/15E态之间也表现不同程度的可逆效应,其中,All1280GAF2具有红色荧光/无荧光变化,其可逆荧光效应尤为明显。大多数DXCF CBCRs的Cx突变体在640-660nm有荧光发射峰,其荧光发射峰与野生型相比有不同程度的红移,且Cx突变体的荧光活性均高于野生型DXCF CBCRs。由于All1280GAF2(C53A)和Air1966GAF2(C56A)具有较高的荧光活性和摩尔消光系数,在荧光显微镜下检测到了两种色素细胞持续的红色荧光。然而,All1280GAF2的荧光发射光谱虽然显示有明显的红色荧光/无荧光变化,但是在荧光显微镜下我们仅检测到了All1280GAF2细胞微弱的可逆红色荧光。利用定点突变技术对All1280GAF2进行分子改造,得到的突变体均没有较强的荧光活性。在对蓝细菌光敏色素A114261的光化学性质的研究工作中,发现A114261全蛋白的表达量不高,且不溶于水。为了便于对A114261的光谱性质进行研究,我们研究了A114261中4个GAF结构域的光化学性质,结果表明仅All4261GAF2能与PCB共价结合。A114261GAF2的吸收峰为590nm,荧光发射峰为645nm,其Cys突变体A114261GAF2(C81L)、All4261GAF2(C113A)均具有较高的吸收和荧光活性,而突变体Al14261GAF2(C124L)在可见光范围没有特征性吸收荧光峰,因此Cys124为All4261GAF2结合PCB色素的位点。此外,本论文还研究了Synechocystis sp. PCC6803中S1r0351的功能。利用同源重组技术构建了⊿slr0351突变藻。比较⊿slr0351突变藻与野生型(WT)在不同培养条件下的生长速率差异,我们发现⊿slr0351突变藻对缺S和缺N胁迫条件十分敏感,由此推测slr0351可能参与S元素和N元素的生物化学代谢调控过程。同时我们还发现slr0351的缺失对藻细胞在弱光照条件下的光能捕获效率有较大影响,而不影响强光条件下藻细胞的光能捕获效率。切除S1r0351N末端的跨膜结构,在E. coliBL21中成功表达了S1r0351截短蛋白,以便于对S1r0351的性质及功能进一步开展研究。
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