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区分死活细胞、检测细胞活性在细胞生物学及医药领域研究中发挥着举足轻重的作用。在生物学中,区分死活细胞是研究细胞凋亡过程的重要工具;在医药领域,区分死活细胞、统计细胞存活率是确认药物药效和细胞毒性的最直接方法。因此,区分检测死活细胞的试剂是生命科学领域的重要研究工具,开发这类工具在生命医学领域意义重大,具有广阔的商业化前景。目前,已经将很多方法应用于细胞凋亡的检测,包括细胞形态分析法,比色法和荧光检测法。其中,荧光检测法具有独特优势（高灵敏度和选择性,实时、可视化原位荧光成像等）,使其在生命科学和医学领域得到了广泛的应用。与只有一种发射颜色的turn-on/off型探针相比,同时具有两个荧光发射峰的比率型荧光探针在成像时可以通过自身两个信号峰的比值进行校正,可以极大地提高检测的准确性。然而,这种以比率的方式检测细胞活性的荧光探针鲜有报道。因此,构建实时原位监测细胞凋亡的比率型荧光探针具迫切需要。在本文中,我们利用pH响应、激发态分子内电荷转移（ESIPT）机制以及荧光共振能量转移（FRET）机制,合理构建出三种比率型荧光探针以检测细胞凋亡。首先设计合成了具有pH响应位点,且对线粒体和RNA均具有靶向能力的迁移性比率型探针PVMR;然后基于ESIPT机制和酯水解酶活性,构建了在双通道模式下区分死活细胞的双光子荧光探针DACA;最后基于FRET原理以及不同分子在ΔΨm变化前后在细胞内的不同迁移位置,利用FRET探针对儿HVQ-MTDR与MTR-1-G-1实现了对细胞凋亡的比率型检测。在第二章中,我们设计了pH值响应,且具有双靶向能力的探针PVMR,用于实时、比率型监测细胞的凋亡过程。探针由pH响应、蓝发射的羟基香豆素和红发射的喹啉盐荧光团构成。在活细胞中,探针靶向具有碱性基质和高膜电位（ΔΨm）的线粒体,在蓝色和红色通道中显示强的荧光信号。在细胞凋亡过程中,ΔΨm显著降低,导致探针从中释放,与嗜碱性RNA结合,探针仅发射红色荧光信号。基于以上过程,PVMR能够以比率的方式观察过氧化氢诱导活细胞的氧化损伤,并监测紫杉醇和鱼藤酮等药物诱导的细胞凋亡过程。在第三章中,我们通过把具有ESIPT特性的荧光染料3-羟基黄酮乙酰化来构建探针DACA。探针的乙酰基部分在活细胞中被具有活性的酯水解酶水解,ESIPT过程的恢复,使细胞中显示出570 nm处的橙色荧光,而在死细胞中只能发射出探针本身在440nm处的蓝色荧光。因此,探针DACA可以以比率的方式区分成像死活细胞,并且在死活细胞中发射波长间隔长达130 nm,这能容易在荧光显微镜下得以区分。此外,该探针具有很好的生物相容性、双光子性质及光稳定性。利用该探针,我们不仅成功检测到由H2O2和紫外（UV）辐射诱导的宫颈癌细胞的凋亡过程,而且利用双光子成像能够辨别死活斑马鱼。在第四章中,基于FRET原理和探针依赖ΔΨm变化的亚细胞器迁移性质,开发了成像细胞凋亡过程的比值型探针对HVQ-MTDR和MTR-1-G-1。这些探针分子都具有优异的光学性能及细胞膜通透性。生物成像实验表明,HVQ与MTDR联用时,在活细胞中,两者之间可以产生FRET效应,在短波激发下给出MTDR的深红色荧光;在死细胞中,FRET过程被阻断,短波激发下深红色通道中的荧光信号逐渐消失,红色通道中的荧光变强。同样的,MTR-1与G-1联用时,通过FRET效应的存在与否,在短波激发下,可以以红色和绿色通道中荧光信号的变化来鉴别死活细胞。HVQ与MTDR联用和MTR-1和G-1联用时都成功以比例的方式监测由过氧化氢和CCCP诱导的细胞凋亡过程。