论文部分内容阅读
目的:研究葡萄糖神经酰胺合成酶(Glucosylceramide synthase ,GCS)和多药耐药基因1(multidrug resistance 1, MDR1)在人白血病多药耐药细胞株K562∕A02细胞耐药形成中基因和蛋白水平的相关性及其协同机制,以便为逆转白血病细胞耐药提供新的思路。方法:(1)利用RT-PCR方法检测野生株K562及其耐药株K562/A02细胞GCS、MDR1基因的表达情况。(2)采用RNA干扰技术(RNA interference ,RNAi),将靶基因为GCS的小干扰RNA (GCSsiRNA)和靶基因为MDR1的小干扰RNA (MDR1siRNA)分别转染K562∕A02细胞48小时后,通过定性和实时定量PCR的方法观察GCS及MDR1 mRNA的基因沉默现象及两者之间的交互影响。(3)利用荧光实时定量PCR检测GCSsiRNA转染K562∕A02细胞24小时后其GCS及MDR1 mRNA的表达情况,并对比分析转染后不同时间点的基因表达,以进一步探讨GCS及MDR1 mRNA的交互影响。(4)将GCSsiRNA和MDR1siRNA分别转染K562∕A02细胞72小时后,提取各组总蛋白,采用传统Western-blot免疫印迹法,分析P-糖蛋白表达差异,从蛋白水平探寻GCS和MDR1的相关性及协同分子病理机制。结果: (1) K562/A02细胞GCS和MDR1 mRNA的表达明显强于野生株K562细胞。(2)RNA干扰实验表明:转染48小时后GCSsiRNA组K562∕A02细胞GCS和MDR1基因的表达均被抑制,抑制率分别为73%(59～82% )和67% (38～82% ),P <0.01;MDR1siRNA组K562∕A02细胞MDR1基因被抑制,抑制率为81(63～91)%, P <0.01,但GCS基因表达无明显差异,P >0.05。(3)GCSsiRNA转染K562∕A02细胞24小时后,以Mock组为对照、GAPDH基因为内标,实验组GCS mRNA表达水平明显受抑制,抑制率为69%(58～78% ), P <0.01;以阴性组为对照,按公式计算,实验组MDR1 mRNA表达水平无明显差异, P >0.05。与GCSsiRNA转染K562/A02细胞24小时比较,转染48小时后MDR1mRNA表达下调65%(54～74%),P <0.01;GCS mRNA表达水平无明显差异,P >0.05。(4)与K562/A02细胞空白组比较,转染72小时后GCSsiRNA组和MDR1siRNA组细胞P-gp表达的相对吸光度值分别下调1.44倍和3.54倍, P<0.05。结论: GCS与MDR1 mRNA的表达在K562/A02细胞呈正相关,特异性的沉默GCS基因可以下调MDR1 mRNA和P-糖蛋白的表达,而且这种下调是继发性的并呈一定的时间依赖性,两者之间可能存在一定的内在调控通路。由此,我们认为葡萄糖神经酰胺合成酶和经典的多药耐药基因1(MDR1)在白血病细胞的多药耐药形成过程中密切相关。