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研究背景:糖尿病足是糖尿病严重慢性并发症之一,糖尿病足创面不同于一般的外科创面,一旦出现,常常迁延不愈,如何促进糖尿病足创面愈合已成为临床上的难点和热点问题。创面负压治疗(negative pressure wound therapy, NPWT )可促进创面的愈合,近些年来,其在糖尿病足创面上的应用逐渐增多。临床随机对照试验和荟萃分析显示,NPWT可加速糖尿病足创面的愈合,但是其促进糖尿病足创面愈合的具体机制尚不十分明确,有待深入研究。成纤维细胞是肉芽组织的主要成份细胞,其在创面愈合过程中逐渐向肌成纤维细胞转化,肌成纤维细胞与成纤维细胞的主要区别是前者表达a-平滑肌肌动蛋白(a-smooth muscle actin, a-SMA),这种特点使肌成纤维细胞在功能上具有收缩的作用,并且与成纤维细胞相比,肌成纤维细胞能具有分泌较大量胶原纤维的作用,因此,肌成纤维细胞在创面修复过程中起着更为重要的作用。转化生长因子β1 (Transforming growth factor β1, TGFβ1)是促进肌成纤维细胞形成的主要细胞生长因子,EDA+纤连蛋白(extradomainAfibronectin,EDA+FN)是促进肌成纤维细胞形成的主要细胞外基质。本研究通过对糖尿病足创面进行NPWT和常规换药治疗,观察创面面积的变化及新生肉芽组织生成情况,观察肌成纤维细胞相关蛋白a-SMA、TGFβ1及EDA+FN在糖尿病足创面肉芽组织的表达及沉积情况,并在细胞水平观察肌成纤维细胞形成情况,研究NPWT对糖尿病足局部创面肉芽组织肌成纤维细胞形成的影响,探讨NPWT促进糖尿病足创面愈合的相关机制。研究方法:1.选取2014年1月到2016年6月符合纳入和排除标准的糖尿病足患者32例,将患者随机分为创面负压治疗组(NPWT组)和对照组(Control, Con组),每组各16例。NPWT组给予创面负压治疗,Con组给予常规换药治疗。2.分别测量两组患者治疗前及治疗后14d创面面积,比较NPWT和常规换药治疗对糖尿病足创面面积的影响。3.两组受试者分别于治疗前及治疗后14d取创面肉芽组织,行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色、Masson 染色、免疫组织化学染色、Western blot、Real-time PCR及细胞培养。4.组织水平研究NPWT对糖尿病足创面肉芽组织中肌成纤维细胞生成的影响。应用HE染色、Masson染色观察两组新生肉芽组织形成情况。应用免疫组织化学染色法、Western blot法观察两组肉芽组织中肌成纤维细胞相关蛋白a-SMA、TGFβ1及EDA+FN的蛋白表达情况;应用Real-time PCR法观察两组肉芽组织中肌成纤维细胞相关蛋白a-SMA、TGFβ1及EDA+ FN的基因表达情况。5.细胞水平研究NPWT对糖尿病足创面肉芽组织中肌成纤维细胞形成的影响。取两组治疗前后肉芽组织,分离、培养成纤维细胞,免疫组织化学染色观察两组治疗前后a-SMA阳性成纤维细胞即肌成纤维细胞的数量,并应用Western blot和Real-time PCR法分析肌成纤维细胞a-SMA的蛋白和基因表达情况。研究结果:1. Con组治疗后,创面面积未见明显缩小(P>0.05),NPWT组治疗后,创面面积明显缩小(P<0.01)。2.组织水平研究结果显示:(1) HE染色和Masson染色结果显示,两组治疗后毛细血管数量及胶原纤维沉积较治疗前均增多(P<0.01),但是与Con组相比,NPWT组治疗后毛细血管数量及胶原纤维沉积较治疗前增多更为显著(P<0.01)。(2)免疫组织化学染色和Western blot结果显示,尽管两组治疗后a-SMA、TGFβ1和EDA+ FN的蛋白表达水平均高于治疗前(P<0.01);但与Con组相比,NPWT组治疗后a-SMA、TGFβ1和EDA+FN蛋白表达水平较治疗前增加更为明显(P<0.01)。(3) Real-time PCR结果显示,两组治疗后a-SMA、TGFβ 1和EDA+ FN mRNA表达量均高于治疗前(P<0.01);但与Con组相比,NPWT组治疗后a-SMA、TGFβ1和EDA+ FN mRNA表达量较治疗前增加更为显著(P<0.01)。3.细胞水平研究结果显示:(1)免疫组织化学染色结果显示,虽然两组治疗后肌成纤维细胞数量较治疗前均增多(P<0.01),但是与Con组相比,NPWT组治疗后肌成纤维细胞数量较治疗前增多更为明显(P<0.01)。(2) Western blot结果显示,尽管两组治疗后肌成纤维细胞a-SMA相对蛋白表达量均高于治疗前(P<0.01),但与Con组相比,NPWT组治疗后肌成纤维细胞a-SMA相对蛋白表达量较治疗前增加更为显著(P<0.01)。(3) Real-timePCR结果显示,两组治疗后肌成纤维细胞a-SMA相对mRNA表达量均高于治疗前(P<0.01);但与Con组相比,NPWT组治疗后肌成纤维细胞a-SMA相对mRNA表达量较治疗前增加更为明显(P<0.01)。研究结论:1.NPWT可明显促进糖尿病足创面肉芽组织的生成,明显缩小糖尿病足创面面积。2. NPWT可显著增加糖尿病足创面肉芽组织肌成纤维细胞相关蛋白a-SMA、TGFβ1和EDA+FN的蛋白和基因表达,可明显增加糖尿病足创面局部肉芽组织肌成纤维细胞的形成。3. NPWT可促进糖尿病足局部创面肉芽组织和肌成纤维细胞形成,这可能是NPWT促进糖尿病足创面愈合的机制之一。