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IFN-α在慢性粒细胞白血病(CML)中疗效显著，可使50﹪-70﹪的CML患者获得血液学完全缓解、10﹪-26﹪获得主要细胞遗传学缓解。IFN-γ在多种实体瘤及某些血液肿瘤的临床试验中治疗效果令人失望；但对慢性粒细胞白血病有肯定的疗效。体外IFN-γ能显著地抑制CML骨髓来源的Ph+原始干(祖)细胞增殖，为Ph-造血祖细胞腾出生长的空间<[8]>；临床试验中，IFN-γ也能使部分CML患者获得完全血液学缓解及细胞遗传学改善<[9]>。
临床上，IFN治疗CML需长期维持治疗，治疗非常不方便；我们实验室既往开展了重组腺病毒IFN-γ基因修饰的骨髓基质细胞抗慢性粒细胞白血病的研究，体外实验及动物实验均获得了良好效果。证实了IFN-γ基因可借助于骨髓基质细胞载体的归巢特性和靶向作用，在造血组织和肿瘤组织中持续表达，发挥抗慢性粒细胞白血病作用。
过量的IFN-γ在抗CML同时能明显抑制和损伤正常造血干细胞，而且基因修饰的骨髓基质细胞在骨髓中原位产生的IFN-γ比外源注射IFN-γ所致骨髓毒性更明显。1996年Selleri等<[29]>使用逆转录病毒把IFN-γ基因转染到骨髓基质细胞中，发现内源产生20 u/ml IFN-γ就有相似于隔天200 u/ml或每周1000 u/ml外源IFN-γ的抑制长期培养起始细胞(long-term culture-initiming cells，LTC-IC)生长和抑制集落(CFU-GM或BFU-E)形成的作用。因而我们既往开展的这种抗白血病基因治疗可能导致大量IFN-γ在骨髓原位产生，而导致严重的骨髓抑制，需建立调控式表达才能试用于临床。 Tet-off系统具有高效、特异、低毒和能严密开关目的基因的特点，在体内也具有良好的调控基因表达效果，该系统并不存在于天然的真核细胞中，可能适合于用来调控人IFN-γ基因在骨髓基质细胞中的表达。
在本研究中，我们构建质粒pTre-IFN-γ，使用脂质体将质粒pTet-off和pTre-IFN-γ共转染小鼠骨髓基质细胞，RT-PCR及ELISA法检测IFN-γ的表达，初步探讨Tet-off系统介导的人IFN-γ基因在小鼠骨髓基质细胞中可调控式表达；达到防治基因治疗中IFN-γ的骨髓毒性的目的。
2．实验方法
2．1 pTre-IFN-γ的构建和鉴定PCR法扩增获得带酶切位点的人IFN-γ基因，SacⅡ和Xba Ⅰ酶切质粒pTre和目的基因，T4连接酶连接酶切产物获得重组体pTre-IFNI-γ。双酶切和测序鉴定重组体。
2．2 小鼠骨髓基质细胞的分离和培养无菌条件下取BALB/C小鼠胫骨，使用1ml注射器以DMEM-LG培养基冲洗骨髓腔，常温下以900RPM/分，离心分离，以DMEM-LG完全培养基(含15﹪胎牛血清，2 mM L-谷氨酰胺，100 units/ml青霉素，100 μg/ml链霉素)重悬细胞，按1×10<6>细胞/cm<2>密度接种于25 cm<2>组织培养瓶中，置于37℃、5﹪CO<,2>细胞培养箱中培养，每天倒置显微镜下观察细胞生长情况，培养3～4天后，全量换液去除悬浮细胞，贴壁细胞继续培养，每3天半量换液1次。约12-18天左右培养至达80﹪融合时，以0.25﹪胰酶(含0.1﹪EDTA)在37℃消化3～5分钟，倒置显微镜下观察，待细胞变为短梭形、类圆形，大多从壁上脱落时中止消化。重悬细胞，接种浓度为2×10<5>/ml，将获得的2～3代骨髓基质细胞用于下一步实验。
2.3 脂质体介导pTet-off与pTre-IFN-γ共转染鼠骨髓基质细胞及检测IFN-γ表达规律取2×10<6>个对数生长期小鼠骨髓基质细胞接种于75cm<2>的培养瓶中，24 h贴壁后用PBS液洗涤两遍，加5 ml无血清LG-DMEM培养液；用250 μ l无菌生理盐水稀释24 μ l HifectinⅡ真核细胞转染试剂，pTet-off和pTre-IFN-γ各6 μg溶于250 μl无菌生理盐水中，混合HifectinⅡ和质粒，室温放置15 min，加入上述准备好的细胞中摇匀；4 h后吸去转染物，PBS液洗涤细胞两遍，加入3 ml全培养液。每天定时更换和收集培养液，实验重复3次。ELISA法检测每天收集的BMSCs培养上清中IFN-γ的分泌量。另外实验组共转染后48小时提取细胞总RNA，行RT-PCR检测IFN-γmRNA在BMSCs中的表达。
2.4 不同浓度盐酸四环素对IFN-γ蛋白分泌的影响取5×10<5>个对数生长期细胞每孔接种于6孔板中，24 h贴壁后按pTet-off、pTre-IFN-γ各2 μ g和Hifectin Ⅱ8 μ l每孔共转染骨髓基质细胞，4 h后吸去转染物，PBS液冲洗2遍，加入1 ml分别含0、1、5、10、100、1000 ng/ml盐酸四环素的全培养液，每种浓度重复3孔，48 h后收集培养液，储存于-20℃备用，作为ELISA法检测IFN-γ分泌量的标本。
2.5 盐酸四环素在不同时间阶段对IFN-γ蛋白分泌的影响取5×10<5>个对数生长期细胞每孔接种于6孔板中，24h贴壁后按pTet-off、pTre-IFN-γ各2 μg和Hifectin Ⅱ8 μl每孔共转染骨髓基质细胞，4h后吸去转染物，PBS液冲洗2遍，加入1 ml无四环素的全培养液，培养48h待有一定基础量IFN-γ蛋白表达后，开始分别使用含0、5、100ng/ml盐酸四环素的全培养液，每种浓度同时做4孔，然后每隔8h换液和收集培养上清；盐酸四环素添加前48h的培养上清、添加四环素后紧接着的3个8 h的培养上清为ELISA法检测IFN-γ分泌量的标本。统计采用SPSS10.0软件包，单处理因素三组方差分析。
3.结果
3.1 酶切电泳鉴定及测序结果重组体双酶切后见3.1 kb的载体和527 bp的目的基因条带，测序显示重组体中人IFN-γ基因序列完全正确，并已定向插入载体质粒pTre，证实重组成功。
3.2 RT-PCR结果共转染组电泳见约527 bp的IFN-γ基因条带及245 bp的β-actin基因条带，非转染组电泳仅见245 bp的β-actin基因条带；证实了共转染的骨髓基质细胞表达IFN-γmRNA，未转染的骨髓基质细胞无表达。
3.3 IFN-γ蛋白的分泌规律每1×10<6>个骨髓基质细胞共转染后前7天的IFN-γ蛋白24 h分泌量(均数±标准差)分别为85.23±52.04 pg、621.95±1 81.39 pg、720.09±241.51 pg、115.79±59.10pg、59.96±31.98 pg、19.93±12.54 pg、1.21±3.32 pg。第3天为分泌高峰，第7天可判断为无IFN-γ蛋白分泌，7天以后和未转染组未检测到IFN-γ蛋白分泌。
3.4 不同浓度盐酸四环素对IFN-γ蛋白表达的调控效应按0、1、5、10、100、1000 ng/ml浓度添加盐酸四环素，5×10<5>个骨髓基质细胞前48 h中IFN-γ蛋白分泌量(均数±标准差)相应分别为：274.93±32.20 pg，186.49±68.69 pg，81.35±22.42 pg，25.60±9.89 pg，6.06±3.49 pg，1.72±2.60 pg。可见48 h蛋白分泌量随四环素增加逐渐减少至接近零。
3.5 盐酸四环素不同作用时间对IFN-γ表达的影响5×10<5>个骨髓基质细胞转染后添加盐酸四环素前的48 h所有孔中均有一定量的IFN-γ基础表达。在含0 ng/ml盐酸四环素的孔中随后3个8 h均有一定量表达；在含5ng/ml盐酸四环素的孔中随后的第1、2个8 h仍有表达，但量较含0 ng/ml四环素组低，第3个8 h表达量更低；在100 ng/ml盐酸四环素的孔中接着的第1个8 h表达量与含0 ng/ml四环素组相比明显降低，后2个8 h基本没有表达。方差分析示0、5、100ng/ml三组比较，无四环素时前48h p>0.05；添加四环素第1、2个8h三组间p<0.05；但第三个8h三组间p=0.055无统计学意义。
4.结论
4.1 Sac Ⅱ、Xba Ⅰ双酶切和测序结果证实质粒pTre-IFN-γ构建成功，人IFN-γ基因成功地插入到质粒pTre中的TRE元件下游。
4.2 脂质体介导pTet-off和pTre-IFN-γ共转染骨髓基质细胞后RT-PCR可检测到IFN-γmRNA表达，ELISA法检测到第三天的IFN-γ分泌高峰为约720pg每10<6>个细胞，分泌持续6天，分泌量较少，但能满足进行四环素的调控实验。
4.3 随添加的盐酸四环素浓度增加，共转染后IFN-γ前48 h分泌量下降，10-100ng/ml的盐酸四环素可接近完全地关闭IFN-γ的表达，抑制效应是高效和严密的；第48 h时添加盐酸四环素后8 h即能明显抑制IFN-γ蛋白表达，抑制效应发生迅速，延长作用时间，抑制效应持续存在。
4.4 以上结果表明，Tet-off系统能对人IFN-γ基因在小鼠骨髓基质细胞中的表达实现迅速而高效的调控。为进一步可调控的抗白血病基因治疗提供了实验基础。