论文部分内容阅读
背景：起源于神经嵴神经外胚层的神经母细胞瘤是儿童中常见的颅外实体瘤。肿瘤的转移是大多数癌症患者死亡的主要原因，是治疗癌症的重要挑战。近年来对神经母细胞瘤治疗的新方法逐渐集中在转移的机制上。2,3-吲哚醌（Isatin）不仅作为一种海洋活性药物发挥抗癌作用，而且是人体内源性物质，具有多种药理学活性，如神经保护，抗菌和抗病毒的活性。我们课题组以前的研究表明，Isatin可以促进细胞凋亡，抑制细胞增殖，也可抑制神经母细胞瘤细胞的侵袭和迁移，且Isatin抑制细胞侵袭和迁移的机制可能与MMP2和MMP9的下调相关。然而，未见有关Isatin对神经母细胞瘤自噬的影响及其与侵袭迁移关系之间的相关报道。本文在前人研究的基础上，应用神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系，研究Isatin对神经母细胞瘤细胞自噬的影响及其与侵袭和迁移的关系，并探讨了可能的机制。 方法：培养神经母瘤SH-SY5Y细胞，用不同浓度(100μmol/L，200μmol/L,300μmol/L)的Isatin处理SH-SY5Y细胞，对照组的细胞不做药物处理。采用transwell侵袭实验检测各组SH-SY5Y细胞的侵袭能力；Transwell迁移实验检测各组SH-SY5Y细胞的迁移能力；吖啶橙染色法检测SH-SY5Y细胞的自噬溶酶体；Real-time PCR检测SH-SY5Y细胞中mTOR信号通路中相关分子Rheb和mTOR的mRNA表达；Western blotting检测自噬标志性蛋白LC3和P62表达水平的变化及自噬相关信号通路蛋白mTOR磷酸化水平。 结果：Transwell小室实验结果显示，与对照组相比，Isatin可显著抑制SH-SY5Y细胞的侵袭和迁移能力。Isatin处理细胞后，SH-SY5Y细胞穿过 Transwell小室的数量明显减少，Isatin对SH-SY5Y细胞侵袭抑制率分别为40.13%，53.16%和75.74%（P＜0.01）。Isatin对SH-SY5Y细胞迁移的抑制率分别为48.1%，67.24%和83.87%（P＜0.01）。吖啶橙染色结果显示，Isatin处理组具有橙红色自噬囊泡的阳性细胞数占总细胞数的比例随着药物浓度的提高而呈现出递增的趋势（P＜0.0001）。Real-time PCR结果显示，与对照组相比，随Isatin浓度的增加，Rheb和mTOR mRNA表达显著下降（P＜0.01）；Western blotting结果显示，随着Isatin浓度的增加，自噬标志性蛋白LC3-II表达量显著增加（P＜0.05），P62表达量显著降低（P＜0.01）；mTOR磷酸化水平显著下降（P＜0.01），且呈浓度依赖关系。 结论：Transwell实验结果显示，Isatin可显著抑制人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的侵袭和迁移。吖啶橙染色法检测了SH-SY5Y细胞的自噬囊泡；Western blotting检测自噬相关蛋白LC3-II和P62表达水平变化；结果提示，Isatin促进SH-SY5Y细胞发生自噬。Real-time PCR检测Rheb、mTOR mRNA相对表达量，结果显示，Rheb、mTOR mRNA相对表达量显著降低；Western blotting检测mTOR的磷酸化水平，结果显示，Isatin处理组mTOR的磷酸化水平随着药物浓度的提高而显著降低。提示Isatin可下调SH-SY5Y细胞Rheb、mTOR的表达。综上所述，Isatin可能通过抑制mTOR信号通路，诱导SH-SY5Y细胞的自噬，进而抑制神经母细胞瘤细胞的侵袭和迁移。