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酞酸酯(Phthalic acid esters,PAEs)是一类环境内分泌干扰物,作为农用塑料地膜的增塑剂被大量使用,由于易从塑料中释放到环境中而成为土壤PAEs污染的主要来源之一。由于PAEs的水解、光解和挥发速率非常缓慢,生物降解是PAEs是在环境中分解的重要途径。尽管土壤中存在许多能降解PAEs的菌种,但由于其自然降解能力极弱,不能满足PAEs环境污染治理的需求。因此,对PAEs的处理最有效的方法是寻求高效降解菌。本实验从污染环境中分离到一株降解率高且较为安全的真菌,围绕该降解真菌的降解特性,降解酶特性和降解酶蛋白表达变化三部分内容展开研究。
(1)降解真菌的筛选及降解特性研究:采用浓度梯度驯化法,从PAEs污染土壤中筛选出土著PAEs降解真菌,通过正交试验筛选其最佳降解条件,并通过检测PAEs含量和菌丝体重量研究其对液体培养基中和灭菌土壤中的3种PAEs(DMP、DEP、DOP)降解效果。结果表明:筛选出的真菌分别为杂色曲霉(Aapergillus Versicolor)和爪哇正青霉(Eupenicillum javanicun)。爪哇正青霉的最佳降解条件为:pH为7,C:N为20:1。该真菌对液体培养基和土壤中的PAEs均有较好的降解效果,在7d试验期内对液体培养基中225mg/L PAEs的最高降解率为65.64％,对3种PAEs在不同浓度下(25、50、75、100 mg/L)的降解率大小顺序为DMP>DEP>DOP,且在PAEs浓度为75mg/L时降解率和菌重均达到最高。在30d试验期内该真菌对灭菌土壤中300mg/kg PAEs最高降解率为65.23％,且培养第一阶段(0-15d)的降解率和菌落数远高于培养的第二阶段(16-30d)。
(2)PAEs降解真菌降解酶特性的研究:通过提取爪哇正青霉菌丝体的胞内酶和胞外酶,研究其降解酶定位、酶活力及纯酶降解效果,并通过测定不同PAEs浓度下(25、50、75、100mg/L)酶蛋白含量变化来测定PAEs浓度对产酶量的影响。结果表明:胞内酶和胞外酶的粗提液12h对150mg/L PAEs降解率分别为57.33％和62.67％,细胞壁酶降解率仅为10.67％,故降解酶定位于胞内和胞外。不同PAEs底物浓度下降解酶活力表现为:酶活力随底物浓度的升高而增大,当PAEs浓度为25mg/L时,胞内酶和胞外酶的酶活力分别为2.89×10-4mmol/min/mgprotein和6.88×10-4mmol/min/mg protein,而当PAEs浓度为100mg/L时,胞内酶和胞外酶的酶活力分别为21.17×10-4 mmol/min/mg protein和36.67×10-4mmol/min/mg protein。胞内酶和胞外酶的总降解率均在50mg/L时达到最高,分别为57.33％和61.33％,且该浓度下爪哇正青霉产生的降解酶最多为0.64μg/μL,可以初步判定该真菌纯酶降解的最佳PAEs底物浓度为50mg/L。
(3)PAEs降解真菌酶蛋白的蛋白组学研究:通过提取爪哇正青霉菌丝体的酶蛋白,采用双向电泳技术,研究在不同PAEs浓度下该真菌降解酶蛋白的差异性表达,并通过质谱鉴定上调蛋白的种类和功能。双向电泳凝胶图像分析结果表明:与0mg/L对照比较,在浓度为50 mg/L、100 mg/L PAEs的诱导下降解菌酶蛋白量有明显变化。产生明显变化的蛋白点有5个,为上调蛋白(蛋白点U1、U2、U3、U5、U7),另外一个新出现的蛋白点为U6。质谱鉴定结果表明:上调蛋白中蛋白点U1、U2、U3、U5及新出现的蛋白点U6有甲醛脱氢酶、醇脱氢酶等活性,推测这些蛋白表达量的增加增强了利用培养基中作为唯一碳源和能源的PAEs的能力,上调蛋白点U7为热休克蛋白hsp90家族的催化酶,推测是通过提高自身热休克蛋白催化酶的表达量来保护其免受高浓度PAEs和中间代谢产物毒性的影响。上述几种表达量上调或新出现的蛋白酶的协同作用可能是降解复合PAEs的一种机制。