论文部分内容阅读
背景:志贺菌又称痢疾杆菌,能侵袭结肠上皮细胞,引起人类细菌性痢疾。按抗原结构和生化反应的不同可分为痢疾(Sh.dysenteriae)、福氏(Sh.flexneri)、鲍氏(Sh.boydii)和宋内氏(Sh.sonnei)志贺菌。志贺菌感染引起的临床症状有:腹泻、痢疾性黏液脓血便、痉挛性腹痛以及里急后重等,甚至危及生命[1,2,3]。细菌性痢疾作为夏秋季常见肠道传染病,发病率高,危害大。福氏志贺菌是近年来细菌性痢疾最为重要的致病菌,而且近年来志贺菌耐药性不断增长,其中也是福氏志贺菌耐药性增加最明显[4]。消化道病原菌种类复杂、致病菌含量相对较低且隐藏在大量杂菌中,容易被漏检。而传统的检测方法必须经过增菌培养、分离培养和初步生化实验以及血清学鉴定等步骤,操作烦琐费时[5]。因此改进病原性细菌尤其是肠道病原菌的检测,建立自动快速定量检测方法是医院临床诊断工作对微生物检验提出的新的迫切要求。免疫磁珠对特定病原菌的特异性捕获分离与富集能力,在消化道病原微生物的检测中具有特别的优势:特异性捕获能将病原微生物从大量杂菌中分离出来,其强大的富集能力可把所占比例很小甚至绝对量很少的病原微生物高效集中,从而提高检测灵敏度和准确性[6]。金黄色葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal protein A,SPA)能与人及多种哺乳动物血清IgG分子中的Fc片段结合,结合后不影响抗体的活性。SPA介导磁珠抗体偶联、富含SPA的金黄色葡萄球菌介导的协同凝集反应经改进发展为免疫比浊方法可方便地应用于病原菌的自动快速定量检测方法研究。目的:以SPA包被的磁珠和富含SPA的金黄色葡萄球菌分别与福氏志贺菌的多抗血清结合,制备福氏志贺菌特异的多抗磁珠和抗体致敏的金黄色葡萄球菌作为协同凝集试剂与免疫比浊试剂,利用免疫比浊分析结合免疫磁分离技术探索其在福氏志贺菌自动快速定量检测中的初步应用。方法:1.复苏、转种福氏志贺菌F1a,经生化反应及血清学鉴定后,大量培养并灭活福氏志贺菌F1a作为免疫原,免疫日本大耳白兔制备多抗血清。2.磁珠包被SPA后再与多抗血清中的IgG偶联,适当固定后制成多抗免疫磁珠。以该磁珠捕获模拟标本的福氏志贺菌,接种MH平板37℃培养18-24h,菌落计数后计算免疫磁珠的特异富集作用。3.与商品化磁珠做对照实验,同时与经典的菌落计数比较。4.富含SPA的金黄色葡萄球菌(No 1800株)经甲醛灭活后,与福氏志贺菌的多抗血清结合,制备特异抗体致敏的金黄色葡萄球菌,作为协同凝集试剂和自动定量检测的免疫比浊试剂。5.在日立7060全自动生化分析仪编制程序进行自动定量检测并进行初步的方法学评价,包括线性范围、灵敏度、重复性、特异性、抗干扰能力。6.与具有细菌定量(流式细胞术)功能的SYSMEX UF-50全自动尿液分析仪做方法对比实验。7.将免疫磁珠和免疫比浊联合应用于福氏志贺菌的自动快速定量检测,对模拟标本先进行免疫磁珠分离富集,再以LB液体培养基适当增菌,然后离心浓缩或延长培养时间后培养液直接上生化分析仪检测,建立福氏志贺菌的自动快速定量检测方法。结果:1.福氏志贺菌F1a免疫日本大耳白兔获得了高质量的多抗血清,特异性好,凝集效价达1:320。2.制备多抗免疫磁珠对福氏志贺菌具有一定的富集作用,菌落计数显示磁珠富集后细菌浓度成倍增加,对检测体系中靶细菌的捕获效率约为30%,商品化磁珠的检测效果基本一致。3.特异性抗体致敏的金黄色葡萄球菌,作为协同凝集试剂和自动定量检测的免疫比浊试剂,在玻片上能与待测福氏志贺菌产生明显的凝集现象,在自动生化分析仪上能实现自动定量检测。4.本研究建立的福氏志贺菌免疫比浊定量检测方法在日立7060全自动生化分析仪上的检测灵敏度达到4×10~5 cfu/ml(绝对菌量为1000 cfu);特异性好,抗干扰能力强,多种临床常见分离菌如大肠杆菌、金葡菌、不动杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌均不与该试剂反应。而福氏志贺菌F2a、F4a型与本研究制备福氏志贺菌F1a免疫家兔的血清抗体有一定的抗原抗体交叉反应;线性良好,达到0.25×10~6-16×10~6cfu/ml。方法的重复性较好,批内试验CV值5.8%,批间试验CV值10.0%。方法对比实验显示在线性范围内与流式细胞原理的细菌定量结果基本一致。5.免疫磁分离技术对模拟标本的福氏志贺菌先行分离富集,再适当培养增菌后仪器自动化免疫比浊法定量检测,初步建立免疫比浊分析结合免疫磁分离技术的福氏志贺菌自动快速定量检测方法,将常规的细菌培养鉴定需时2-3天缩短至数小时,并实现病原菌定量检测。结论:以福氏志贺菌的多抗血清分别致敏SPA包被的磁珠和富含SPA的金黄色葡萄球菌,制备特异的多抗磁珠对福氏志贺菌有一定的特异捕获与富集作用,抗体致敏的金黄色葡萄球菌作为协同凝集试剂与免疫比浊试剂对福氏志贺菌的自动、快速、定量检测具有较好的效果,免疫比浊分析结合免疫磁分离技术为病原菌的快速诊断和自动定量分析提供了新的思路。