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目的:肿瘤干细胞(Cancer Stem Cells,CSCs)对肿瘤的发生发展过程至关重要。Wnt/β-catenin信号通路在维持肿瘤干细胞的干性中起着关键性的作用。迄今,有关miR-19调控Wnt/β-catenin信号通路、影响肺癌干细胞活性的作用尚未阐明。本研究旨在探讨miR-19/GSK3β/β-catenin轴介导肺癌干细胞活性的调控作用及分子机制。方法:在无血清培养基(Serum-free medium,SFM)中,利用体外克隆成球法即悬浮细胞球培养法从肺癌细胞株A549和H1299细胞中分离富集肺癌干细胞,同时利用Western blot分析肺癌干细胞标记物的表达水平,鉴定悬浮细胞球的肿瘤干细胞特性,建立肺癌干细胞的体外培养模型。本研究首先探讨了 miR-19对肺癌干细胞的调控作用:qRT-PCR技术检测肺癌干细胞球中miR-19a和miR-19b的表达水平;在A549和H1299细胞中转染miR-19 mimic/inhibitor,并利用克隆成球实验鉴定转染细胞的悬浮成球能力、qRT-PCR和Western blot实验分析肺癌干细胞标志基因的表达水平。其后,我们研究了 Wnt/β-catenin通路对肺癌干细胞活性以及miR-19对Wnt/β-catenin通路的调控作用:利用Western blot检测悬浮细胞球中Wnt/β-catenin通路相关分子的表达水平;运用siRNA转染技术沉默Wnt/β-catenin通路后,Western blot实验分析肺癌干细胞标记物及凋亡相关蛋白的表达水平;细胞转染miR-19 mimic/inhibitor后检测Wnt/β-catenin通路活性的改变,qRT-PCR分析mRNA水平、Western blot分析蛋白水平,双荧光素酶报告基因实验分析β-catenin/TCF的转录活性。为进一步阐明miR-19对Wnt/β-catenin通路的调控机制:我们采用生物信息学方法分析miR-19与GSK3β 3’-UTR区(3’-Untranslated Regions)是否存在结合位点;利用 qRT-PCR、Western blot 方法分析miR-19对GSK3β mRNA和蛋白表达水平的影响;同时,构建GSK3β 3’UTR的野生型(Luc-wt-GSK3β 3’UTR)和突变型(Luc-mut-GSK3β 3’UTR)报告基因质粒,与miR-19 mimic/inhibitor共转染,荧光素酶报告基因实验分析miR-19对GSK3β翻译活性的影响,以验证miR-19与GSK3β的直接靶向作用。结果:一、肺癌干细胞的分离与富集本研究首先利用体外克隆成球法富集肺癌干细胞。在SFM中,两种肺癌细胞株A549和H1299细胞均能形成悬浮细胞球;同时,qRT-PCR与Westen blot结果表明,与贴壁有血清(Serum-supplemented medium,SSM)培养的细胞相比,悬浮培养的A549和H1299细胞球高表达肺癌干细胞标记物CD133、CD44和ALDH1A1,以及多能干细胞因子Nanog和Oct4,表明悬浮细胞球具有肺癌干细胞的性质。二、miR-19促进肺癌干细胞的活性qRT-PCR结果显示,A549和H1299细胞球中miR-19a和miR-19b的表达水平均显著增高,与贴壁对照组细胞相比,表达量增加4～5倍,提示miR-19可能参与肺癌干细胞活性的调控。在 A549 和 H1299 细胞中转染 control mimic、miR-19a/miR-19b mimics、control inhibitor和miR-19a/miR-19b inhibitors后,再进行无血清悬浮培养。体外克隆成球实验显示,与对照组相比,转染miR-19a/miR-19b mimics的细胞悬浮成球能力增强;同时,qRT-PCR和Wertern blot结果表明,miR-19 mimic能增加肺癌干细胞标志基因(CD133、CD44、ALDH1A1、Nanog和Oct4)的表达水平;而miR-19a/miR-19b inhibitors则明显抑制细胞悬浮成球能力,并降低肺癌干细胞标记物的表达。三、Wnt/β-catenin通路维持肺癌干细胞活性Western blot实验表明,肺癌干细胞中Wnt/β-catenin通路活性上调。在悬浮培养的A549和H1299细胞球中,GSK3β的表达水平下降,而p-GSK3β(Ser9)(GSK3β的失活形式)和β-catenin的表达水平上升。siRNA转染实验表明,转染β-catenin siRNA抑制Wnt/β-catenin通路后能显著降低肺癌干细胞标志基因的表达水平,包括CD133、CD44和Nanog,同时促进A549和H1299细胞球发生凋亡,凋亡相关蛋白Bax和Cleaved Casβase 3(Casβase 3活性形式)的表达水平明显上升。四、miR-19调控Wnt/β-catenin通路的激活细胞转染实验显示,过表达miR-19a/miR-19b可激活Wnt/β-catenin通路,上调β-catenin及靶基因c-Myc和Cyclin D1的表达水平;而沉默miR-19则会阻断Wnt/β-catenin通路。双荧光素酶报告基因实验同时证实,miR-19高表达可增强β-catenin的转录活性,而低表达miR-19则抑制β-catenin的转录过程。五、GSK3β是miR-19a和miR-19b的靶基因生物信息学软件分析比对结果提示,GSK3β 3’UTR区存在miR-19a和miR-19b的结合位点;Western blot和qRT-PCR分析结果表明,外源性高表达miR-19可降低GSK3 β mRNA和蛋白的表达水平;而在miR-19低表达的细胞中,GSK3β的表达水平则升高。双荧光素酶报告基因实验显示,miR-19 mimic可抑制 Luc-wt-GSK3β 3’UTR质粒的荧光强度,miR-19 inhibitor 则增加 Luc-wt-GSK3β3’UTR质粒的荧光强度;而Luc-mut-GSK3β 3’UTR报告基因质粒的荧光活性不受miR-19 mimic/inhibitor的影响。研究结果证实了 miR-19直接靶向GSK3β。结论:本研究发现肺癌干细胞中miR-19a/miR-19b的表达水平上调、Wnt/β-catenin通路激活。过表达miR-19a/19b可增强细胞悬浮成球能力、升高肺癌干细胞标志基因的表达水平,同时促进Wnt/β-catenin通路的激活和β-catenin/TCF的转录活性;反之,低表达miR-19显著抑制肺癌干细胞及Wnt/β-catenin通路的活性。我们进一步研究证实,miR-19可直接靶向Wnt/β-catenin通路的关键负调控因子GSK3β进而激活该通路。综上所述,本研究首次揭示了 miR-19/GSK3β/β-catenin网络对肺癌干细胞活性的调控作用,可望为深入探索肺癌干细胞的分子调控机制提供新的思路与理论依据。目的:肿瘤干细胞(Cancer Stem Cells,CSCs)是肿瘤的起始和驱动细胞。miR-19和Wnt/β-catenin信号通路对肿瘤干细胞的调控起着关键性的作用。天然食物中富含的植物化学物具有靶向抑制肿瘤干细胞的特性,被认为是理想的癌症预防与治疗的活性成分。莱菔硫烷(Sulforaβhane,SFN)是广泛存在于十字花科植物的异硫酸氰盐类(Isothiocyanates,ITCs)物质,目前,有关SFN对肺癌干细胞的干预作用及机制尚未阐明。因此,本研究旨在研究SFN抑制肺癌干细胞的效应,同时揭示miR-19/GSK3β/β-catenin轴介导SFN对肺癌干细胞的干预作用机制。方法:利用体外克隆成球法从肺癌细胞株A549和H1299细胞中分离富集肺癌干细胞,探讨SFN对肺癌干细胞活性的干预作用及机制。首先利用体外克隆成球实验、qRT-PCR、Western blot实验检测SFN对肺癌干细胞的抑制效应,流式细胞术分析CD133阳性细胞数的变化;同时,检测肺癌干细胞增殖与凋亡的改变,Western blot测定相关蛋白表达水平、流式细胞术检测细胞凋亡。采用Wnt/β-catenin通路激活剂LiCl进一步研究SFN对Wnt/β-catenin通路抑制作用的机制;Western blot实验分析肺癌干细胞标记物和Wnt/β-catenin通路的蛋白表达水平、双荧光素酶报告基因实验分析β-catenin转录活性。为深入探索miR-19调控Wnt/β-catenin通路及SFN对肺癌干细胞的干预效应,以qRT-PCR方法分析SFN处理后A549和H1299细胞球中miR-19a和miR-19b的表达水平;用miR-19 mimic转染细胞并联合SFN处理,通过细胞悬浮成球和Western blot实验分析肺癌干细胞活性及Wnt/β-catenin通路的改变。结果:一、SFN抑制肺癌干细胞的活性不同浓度的(0、1、5和15 μM)SFN处理A549和H1299细胞球7天后,观察肺癌干细胞活性的改变。体外克隆成球实验显示SFN对肺癌干细胞具有抑制效应,SFN可剂量依赖性地减小悬浮细胞球的体积、降低细胞球的数量、并下调肺癌干细胞标记物mRNA和蛋白的表达水平,同时流式细胞术实验也表明,不同浓度的SFN可显著减少A549细胞球中CD133阳性细胞的比例。二、SFN抑制肺癌干细胞增殖,促进细胞凋亡0-15 μM SFN处理肺癌干细胞7天后,检测增殖、凋亡相关蛋白的变化。Wertem blot结果表明,增殖相关蛋白PCNA和Cyclin D1的表达水平下降;抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平减少而促凋亡蛋白Bax和Caspases家族(Caspase 8、Caspase 9、Caspase 3)的表达则增加。流式细胞术实验进一步显示,SFN可诱导A549和H1299肺癌干细胞凋亡。三、SFN通过Wnt/β-catenin通路发挥对肺癌干细胞的干预作用qRT-PCR与Weserten blot结果表明,SFN抑制肺癌干细胞中Wnt/β-catenin通路的激活,表现为β-GSK3β(Ser9)蛋白水平下降、GSK3β蛋白水平上升、β-catenin蛋白水平降低以及Wnt/β-catenin通路下游靶基因(c-Myc和Cyclin D1)mRNA和蛋白的表达均下调。双荧光素酶报告基因实验同时证实,SFN抑制β-catenin的转录活性。当Wnt/β-catenin通路由其激活剂LiCl激活时,Western blot实验表明,LiCl能逆转SFN对Wnt/β-catenin通路的抑制效应,由SFN引起的GSK3β、β-catenin、c-Myc和Cyclin D1蛋白表达水平的变化,均可被LiCl逆转;同时SFN下调的肺癌干细胞标志物(CD133、CD44、ALDH1A1、Nanog和Oct4)表达水平也可被LiCl逆转。四、miR-19/GSK3β/β-catenin介导莱菔硫烷对肺癌干细胞干预作用qRT-PCR检测结果显示5μM和15 μM SFN能显著抑制A549和H1299细胞球中miR-19a和miR-19b的表达水平。当用SFN处理已转染miR-19a/miR-19b mimics的A549和H1299细胞球时,miR-19能部分逆转SFN对肺癌干细胞活性的抑制效应,同时SFN阻断Wnt/β-catenin通路激活的作用可被miR-19a/miR-19b mimics消除,Western blot结果表明,由SFN上调的GSK3β和下调的β-catenin、c-myc、Cyclin D1的表达水平也可被miR-19逆转。结论:SFN可抑制肺癌干细胞的活性,减小悬浮细胞球的体积和数量,降低CD133细胞数量,同时抑制肺癌干细胞增殖,促进其凋亡;SFN能抑制肺癌干细胞中 Wnt/β-catenin信号通路和下调 miR-19表达;SFN通过miR-19/GSK3β/β-catenin网络发挥对肺癌干细胞的干预作用。研究结果将为肺癌干细胞的靶向干预作用研究提供科学依据。