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研究目的： 多糖是一类重要大分子物质，具有多方面的药理学活性，其作用主要包括:免疫调节、抗氧化、抗肿瘤、降血脂、抗病毒、降血压、降血糖、增强骨髓造血机能等等。多糖的这些良好的药理活性，以及几乎无毒性的优点，愈来愈引起国内外生物化学家、药理学家的兴趣。 研究发现从香菇（Lentinus edodes）分离的β-葡聚糖LNT-S、从酿酒酵母（S.cerevisiae）分离的β-葡聚糖BBG均能抑制LPS诱导的炎症因子NO，TNF-α，IL-1等的表达。这种抑制作用是通过抑制丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路的ERK1/2和JNK1/2的磷酸化而实现的。除了这两种β-葡聚糖外，是否还有其它具有α或者β-葡聚糖结构的多糖具有类似的生物学功能？是否所有D-葡聚糖结构的多糖均具有这种生物学活性？换言之，这种构效关系是否具有通用性？解决这些问题需要选择更多的含葡聚糖结构的多糖去验证和研究。 本课题是在实验室前期工作的基础上开展，主要对2种以D-葡聚糖为主链的多糖的免疫调节作用及相关分子机制进行研究。一种是来源于甘蓝黑腐病黄单胞菌(Xanthomonas camperstris)细菌胞外杂多糖黄原胶(xanthan gum，XG)，另一种是来源于贻贝（Mytilus coruscus）的均多糖(Mussel polysaccharide，MP-A)，两者都属于以D-葡聚糖为主链的高分子多糖。前期研究结果表明XG治疗骨关节炎动物实验研究取得很好的效果，MP-A调血脂、抗炎功能的动物实验研究疗效较好，两者均无显著毒副作用，良好安全性和有效性预示着优良的成药性和开发前景。 多糖的生物学活性与多糖的一级结构、高级结构和理化性质密切相关。XG和MP-A虽然来源不同，但与LNT-S和BBG相似的是它们的主链中也含有D-葡聚糖结构，XG是含β-D-葡聚糖主链结构的杂多糖，而MP-A是含α-D-葡聚糖结构的同多糖。它们是否与已报道的LNT-S和BBG具有相似的生物学活性和分子机制尚未可知，目前对于这两种多糖的免疫药效学活性尚缺乏相关的研究数据。 因此，本文对这2种多糖的免疫药理学活性进行考察，试图确定其细胞外靶标受体和胞内的分子传导机制。主要通过研究XG对小鼠RAW264.7巨噬细胞的影响，考察其体外免疫调节活性，特别考察XG对脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)诱导活化的巨噬细胞的作用，确证其可能结合的受体，进一步通过多种技术手段胞内信号传导机制。通过研究MP-A对人THP-1巨噬细胞的影响，考察MP-A体外免疫调节作用，特别是MP-A对LPS诱导活化的THP-1细胞的作用，寻找和确证MP-A细胞表面受体，进而初步研究其胞内的信号传导机制。 最后比较总结两种D-葡聚糖结构多糖XG和MP-A的免疫调节活性的特点及作用机制的异同，为活性多糖的构效关系研究提供更多的实验数据。 研究方法： 1.XG体外免疫药理学效应研究 首先以小鼠RAW264.7细胞作为体外实验体系，以LPS诱导的RAW264.7细胞作为炎症模型，采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒检测测XG对其增殖或者毒性作用。主要试验方法包括:扫描电镜(scanning electron microscopy，SEM)观察XG对小鼠RAW264.7细胞形态的影响;流式细胞仪检测细胞吞噬FITC-dextran实验来分析其对巨噬细胞吞噬功能的影响;Griess试剂法测定RAW264.7细胞经XG作用后产生NO的水平变化;ELISA试剂盒测定XG对RAW264.7细胞分泌IL-1β、IL-6及TNF-α细胞因子的影响;荧光定量RT-PCR分析XG对RAW264.7细胞iNOS、COX-2、IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA水平变化的影响;此外采用Western blot实验考察了XG对LPS诱导的RAW264.7细胞iNOS、COX-2蛋白表达量的影响，并运用SPR技术分析XG与重组TLR4的结合情况。 2.XG作用于TLR4胞内信号转导机制研究 采用小鼠RAW264.7细胞系，研究XG对LPS活化的巨噬细胞胞内信号传导分子机制，包括:用透射电镜(transmission Electron Microscope，TEM)观察XG对RAW264.7胞内细胞超微结构的影响;用Griess试剂法测定用抗小鼠TLR4抗体共孵育RAW264.7细胞30分钟后经XG作用后产生NO的水平变化;机制研究采用Western blot实验检测XG对RAW264.7细胞中丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)途径相关蛋白的表达以及免疫荧光检测核转录因子（nuclear factor-κ-gene binding，NF-κB）的核转运的影响，并运用SPR技术分析XG除了TLR4外与已知的常见其它受体dectin-1和TLR2的结合情况。 3.MP-A作用于活化的THP-1巨噬细胞TLR4受体的药理学效应及机制的研究 以人THP-1细胞作为体外实验体系，以LPS诱导的THP-1巨噬细胞作为炎症模型，采用CCK-8试剂盒检测测MP-A对其增殖或者毒性作用。主要试验方法包括:流式细胞仪检测THP-1细胞吞噬FITC-dextran实验来分析MP-A对巨噬细胞吞噬功能的影响;Griess试剂法测定THP-1细胞经MP-A作用后产生NO的水平变化;ELISA试剂盒测定MP-A对THP-1细胞分泌TNF-α和PGE2的影响;此外采用Western blot实验考察了MP-A对LPS诱导的THP-1细胞iNOS、COX-2蛋白以及MAPKs和NF-κB途径相关蛋白表达的影响，同时用免疫荧光检测了MP-A对NF-κB的核转运的影响，运用SPR技术分析MP-A与重组TLR4、dectin-1和TLR2的结合情况。 研究结果： 实验证明，两者均具有免疫调节活性，能够下调活化的巨噬细胞中炎症因子的表达。通过使用表面离子共振技术(SPR)考察了2种多糖与细胞表面已知的受体Dectin-1，TLR4和TLR2的亲和力，并确证了TLR4是介导这2种多糖的受体。 1.体外实验表明XG和MP-A均具有免疫调节活性，能够下调LPS活化的炎症因子NO、TNF-α、白介素(IL)或前列腺素2(PGE2)等的表达。同时XG和MP-A具有增强巨噬细胞吞噬FITC-dextin功能的作用，表现出一定的免疫原性。暗示了XG和MP-A可能具有双向调控的作用，同时说明炎症因子和吞噬功能可能是由不同的机制引起。 2.初步确定了XG和MP-A均可并由胞外TLR4受体识别，通过调节下游的丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)的磷酸化与核转录因子NF-κB的活化和核移位等方式完成胞内信号传导而发挥药理学作用。 3.XG和MP-A下调活化的巨噬细胞炎症因子，同时可以抑制TLR4通路中的MAPK和NF-κB相关蛋白，表现出较强的抗炎活性，可用于炎性疾病治疗药物的开发。认为XG和MP-A可通过与LPS竞争性结合TLR4蛋白，抑制了TLR4下游胞内信号主要是MAPK通路中的ERK和JNK蛋白的磷酸化而发挥抗炎的功能。这与研究报道的另外两种β-葡聚糖LNT-S和BBG结果一致，暗示了D-葡聚糖结构可能是其生物学活性的必需基团。 研究结论： 1.本文首次研究了XG和MP-A体外免疫调节活性，研究了它们对巨噬细胞炎症因子的表达，吞噬功能，以及胞内相关蛋白表达的影响。 2.首次通过SPR技术研究了XG和MP-A分别和常见受体dectin-1、TLR4和TLR2的亲和力。首次确证了这XG和MP-A细胞表面受体为TLR4。 3.首次考察了XG和MP-A通过TLR4受体的胞内信号传导途径，进一步证实二者是通过调节下游的丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)的磷酸化与核转录因子NF-κB的活化和核移位等方式完成胞内信号传导而发挥抗炎药效，为XG和MP-A用于治疗炎性疾病的提供新见解。