【摘 要】
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甘草酸（glycyrrhizic acid,GA）为齐墩果烷型五环三萜皂苷,具有抗炎、保肝、抗病毒、抗氧化、免疫调节等药理作用,是中药甘草最重要的活性成分之一。目前,GA代谢途径已被破译,然而其调控机制尚不清晰。已有许多报道证实,转运蛋白、调控蛋白,包括转录因子（TF）、转录调节因子（TR）以及蛋白激酶（PK）等,对植物次生代谢途径具有重要调控作用。合成生物学和代谢工程的蓬勃发展,使得人工重建植物
【基金项目】
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国家重点研发计划项目“高品质道地中药材甘草、黄芩、金荞麦规模化种植及精准扶贫示范研究”（2017YFC1701400）
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甘草酸（glycyrrhizic acid,GA）为齐墩果烷型五环三萜皂苷,具有抗炎、保肝、抗病毒、抗氧化、免疫调节等药理作用,是中药甘草最重要的活性成分之一。目前,GA代谢途径已被破译,然而其调控机制尚不清晰。已有许多报道证实,转运蛋白、调控蛋白,包括转录因子（TF）、转录调节因子（TR）以及蛋白激酶（PK）等,对植物次生代谢途径具有重要调控作用。合成生物学和代谢工程的蓬勃发展,使得人工重建植物次生代谢途径在植物次生代谢产物生物合成方面具有独特的优势。烟草（Nicotiana tabacum）因为其组织容易进行操作,而且具有很强的再生能力,长期以来作为分子生物学和基因工程的模式植物。为在烟草中异源合成GA筛选高效的生物学元件、探索甘草酸代谢的调控机制,本论文在课题组前期甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch）转录组测序与分析的基础上,继续构建了烟草根、茎、叶不同组织的转录组文库,并通过农杆菌介导的烟草瞬时转化体系和甘草转基因毛状根诱导体系对GA代谢途径的调控基因和转运蛋白基因进行了初步验证。本论文得到的主要研究结果有:1.烟草不同组织转录组研究（1）通过与公共数据库比对,共预测到61个齐墩果烷型三萜上游代谢途径的结构基因,8,257个转运蛋白,3,840个TF,849个TR和2,141个PK。（2）通过ASprofile软件共预测到烟草中99,508个可变剪接（Alternative Splicing,AS）事件,包括4,847个“外显子跳跃”类型（ES）,40,486个“最后一个外显子可变剪接”类型（TTS）,41,475个“第一个外显子可变剪接”类型（TSS）和6,370个“单内含子滞留”类型（IR）。其中齐墩果烷型三萜上游途径的所有结构基因均发生了 TSS和TTS形式AS。（3）通过对基因表达水平的分析,以根作为对照,在叶、茎中分别得到23,628和7,375个差异表达基因（DEGs）,并通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）证明了差异表达的真实性。（4）通过共表达分析筛选到5,089个转运蛋白、2,198个TF、676个TR和1,383个PK至少与1个齐墩果烷型三萜上游代谢途径的结构基因具有高相关性。2.齐墩果烷型三萜上游代谢途径相关TFs的鉴定（1）通过查阅多篇文献,可知NAC、bHLH和bZIP转录因子与三萜化合物次生代谢密切相关。经分析,有43、9和24个齐墩果烷型三萜上游途径结构基因的启动子区分别具有NAC、bHLH和bZIP转录因子结合域,进一步佐证了NAC和bZIP转录因子可能参与三萜上游代谢途径的调控。（2）结合烟草转录组共表达分析结果,分别筛选与结构基因相关个数最多的NAC和bZIP家族TFs,得到烟草中的候选基因gene36684（NAC）和gene19809（bZIP）。通过农杆菌介导的瞬时转化法和qRT-PCR法验证了过表达gene36684和gene19809能够促进了齐墩果烷型三萜上游途径大部分结构基因的表达,包括限速酶基因HMGR。3.GA下游代谢途径相关调控基因的鉴定（1）检索甘草与烟草转录组文库中共有的TR、PK和转运蛋白（重点关注定位在内质网的）,筛选与GA下游代谢途径酶基因具有强相关性的甘草中的调控基因和转运蛋白基因,通过甘草转基因毛状根诱导体系验证了转运蛋白基因-Glyur000 172s00014892、TR-Glyur00000 1s00000207、PK-Glyur000446s00029771对GA下游代谢途径酶基因的表达表现了明显的促进作用。综上,本论文构建了烟草不同组织的转录组文库,首次从转录水平对烟草齐墩果烷型三萜上游代谢途径调控机制进行了综合分析。首次挖掘了烟草中参与齐墩果烷型三萜合成的调控基因和转运蛋白基因,并通过农杆菌介导的瞬时转化鉴定了烟草中2个TFs对三萜上游结构基因的表达具有促进作用;通过甘草转基因毛状根诱导体系,鉴定了甘草中1个转运蛋白基因、1个TR和1个PK基因对GA下游代谢途径酶基因的正向调控作用。本研究为在烟草中进行GA生物合成筛选了生物学原件,对进一步解析GA的调控机制具有重要意义。
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