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前言:
前列腺癌是美国男性中最常见的恶性肿瘤,据美国癌症协会调查显示,2008年美国前列腺癌的新发病例是186,320例,而死于前列腺癌的病例数为28,660。随着人均寿命的延长和膳食结构的改变,我国前列腺癌的发病率正在逐年升高。前列腺癌的发生发展是一个多基因改变,多因素作用的共同的结果,因而对前列腺癌发病机制的进一步研究显得至关重要。
锌是人体必须的微量营养元素之一,是体内200多种含有锌指结构的酶和转录因子保持活性并参与细胞结构组成及催化活性的必要组成部分,其在精液中能促进精子的生成、成熟、激活、获能过程,对男性生殖功能有很重要的作用。研究已经表明锌缺乏会导一系列疾病,包括致发育迟缓,DNA合成受损,免疫功能缺陷,及诱发皮肌炎等疾病,目前的研究进一步显示与锌相关一些酶在缺氧,血管生成,细胞增殖和肿瘤转移中扮有重要角色,表明其在肿瘤的发生发展中起到至关重要的作用。
近几十年来,尽管国内外在前列腺癌发病机制方面进行了广泛的临床和实验研究,然而其发病机理还不是很清楚。目前研究普遍认为与其他软组织相比较,前列腺组织具有特异性的聚集高浓度锌的能力,此聚集高浓度的锌离子功能是由前列腺组织外周带具有高度特异性的腺分泌上皮细胞所完成的而总所周知前列腺的外周带是前列腺癌的最好发部位。近50年的研究已经一致表明正常前列腺外周带与前列腺癌外周带锌含量分别为为3000-4500,400-800(nmols/g,湿重),与正常前列腺组织相比,前列腺癌组织中锌浓度下降达66.5%,而与正常前列腺外周带相比,锌含量下降了70-85%,同时研究也发现在前列腺癌发生的早期,组织的锌已经丌始下降,而近期又有多个研究显示在在胆囊癌,肝癌及前列腺癌患者的血液中锌离子办显著下降,因而推测锌在前列腺癌的发生发展中有可能起到很重要的作用。
新近发现的与锌调节相关的两种锌转运蛋白家族,一个是由SLC30基因编码的ZnT蛋白家族,一个是由SLC39基因编码的ZIP蛋白家族,ZnT家族主要是将锌离子转出细胞或促使锌进入细胞内的囊泡从而降低细胞内锌的浓度,而锌铁调控蛋白(ZRT,IRT-likeprotein,ZIP)家族主要功能是将锌离子转入细胞内或促进囊泡内锌的释放增加细胞内锌的浓度,两者共同作用维持细胞内锌离子的稳定。锌铁调控蛋白与许多恶性肿瘤的进展有关,其在乳腺癌和胰腺癌进展中作用已经得到部分证实。目前Desouki等的研究认为ZIP1,ZIP2和ZIP3在前列腺癌中表达均下调同时伴锌水平下降,表明ZIP1,ZIP2和ZIP3可能是一个抑癌基因。ZIP4是ZIP家族的一个新成员,由SLC39A4基因编码合成,其在肠道锌的吸收和囊泡中锌的释放中起到重要的作用。研究显示ZIP4的表达缺失与肌皮炎相关,其过表达与胰腺癌的发生有着密切关系。但到目前为止,ZIP4在前列腺癌中的作用及其生物学机制还不是很清楚。
本研究旨在明确ZIP4在前列腺癌组织中表达情况,并通过体外实验探讨其在前列腺癌发生发展中的作用,为进一步的研究奠定基础。
方法:
1、检测ZIP4在前列腺癌组织中mRNA和蛋白的表达情况,统计分析ZIP4基因的表达情况与前列腺癌临床病理特征间的关系,分析ZIP4基因表达的临床意义。
(1).免疫组化检测30例前列腺癌和30例前列腺增生组织中ZIP4的表达情况;
(2).利用Real-timeRT-PCR和Westernblot法检测前列腺组织中ZIP4的mRNA和蛋白表达情况;
2、根据前期试验检测结果构建稳定ZIP4过表达细胞株(DU145-ZIP4),观察ZIP4过表达对前列腺癌DU145细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响。
(1).MTT法检测ZIP4过表达对DU145细胞增殖能力的影响;
(2).Transwell侵袭试验检测ZIP4过表达对DU145细胞侵袭能力的影响;
(3).Transwell迁移试验及划痕试验检测ZIP4过表达对DU145细胞迁移能力的影响:
3、利用RNA干扰技术,将ZIP4shRNA稳定转染前列腺22RV1细胞,观察RNA干扰对22RV1细胞增殖,侵袭、迁移能力及MMP-2的影响。
(1).MTT法检测干扰后22RV1细胞的增殖活性;
(2).Transwell侵袭试验检测干扰后细胞的侵袭能力;
(3).Transwell迁移试验检测干扰后细胞的迁移能力;
(4).Elisa法检测干扰后22RV1细胞MMP-2的分泌水平;
结果:
1、免疫组化检测结果显示ZIP4在前列腺癌组织中表达的阳性率为13%,而在前列腺增生组织中的阳性率为93.3%,差异显著(P＜0.05)。Real-timeRT-PCR及Westernblot显示ZIP4在前列腺癌组织中表达显著下降,与前列腺增生组织相比差异具有统计学意义(P＜0.05)。ZIP4mRNA在前列腺增生组织中的平均表达含量为前列腺癌组织中的49.1倍,在不同分级的前列腺癌之问ZIP4mRNA表达水平无显著性差异(X2=0.589,P=0.745),Gleason评分与ZIP4mRNA的表达水平无相关性(r=0.012,P=0.968)。
2、RealTimeRT-PCR及WesternBlot检测ZIP4在22RVl,DU145,PC-3三种前列腺癌细胞株中的表达量,结果显示:ZIP4在22RV1中表达量最高,PC-3居中,DU145最少。成功构建ZIP4过表达细胞株DU145-ZIP4。应用MTT、Transwell侵袭试验、Transwell迁移试验机划痕试验分别检测其增殖、侵袭和迁移能力,结果显示ZIP4过表达后DU145细胞的增殖及侵袭能力均显著下降,差异具有统计学意义(P＜0.05),而迁移能力未见明显变化(P＞0.05)。
3、利用前期检测结果成功构建22RV1-shZIP4细胞株,应用MTT、Transwell侵袭试验、Transwell迁移试验和Elisa分别检测列腺癌22RV1-shZIP4,22RV1-shV及22RV1细胞的增殖、侵袭、迁移能力及MMP-2的分泌量的变化,结果显示干扰后22RV1-shZIP4细胞的增殖和迁移能力显著提高,差异具有显著统计学意义(P＜0.001),其细胞培养液中MMP-2的分泌量显著上升,与22RVl组相比,增加了57.35%。差异具有显著统计学意义。
结论:
1、ZIP4在mRNA及蛋白水平,在前列腺癌中的表达含量与其在前列腺增生组织的表达量相比均显著下降,有可能成为前列腺癌的一个诊断指标。
2、ZIP4在DU145-ZIP4细胞中的过表达能够显著地降低DU145细胞的增殖能力和侵袭能力,表明ZIP4有可能是前列腺癌的一个抑癌基因。
3、干扰后的22RV1-shZIP4细胞,其增值能力及侵袭能力均显著上升,进一步表明ZIP4很可能是前列腺癌的一个抑癌基因。干扰后22RV1-shZIP4细胞中MMP-2的分泌量显著上升,表明ZIP4有可能通过调节MMP-2的表达进而促进或减弱前列腺癌细胞的侵袭能力。