狗牙根ASR基因的克隆和功能分析

来源 :华南农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:tltim2009
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狗牙根(Cynodon dactylon L.)是最重要的暖季型草坪草之一,耐旱、耐高温、维护简单,在温带地区广泛运用于草坪建设和牲畜饲养。  ABA(Abscisic acid)是植物生长过程中应对环境胁迫的一种重要信号。ABA在气孔关闭、渗透物聚积等过程中起调节作用,也诱导LEA蛋白、热休克蛋白等胁迫相关蛋白及活性氧清除剂的合成。  本研究以狗牙根为材料,构建了ABA诱导的Solexa表达谱文库,利用Solexa测序技术对狗牙根转录本A1(对照)、A2(短时间处理)和A3(长时间处理)进行分析,再和数据库进行比对,得到7040个基因。以两倍表达(或抑制)和错误发现率(false discovery rate,FDR)FDR<0.05为标准,筛选出179个显著上调的基因和97个显著下调的基因,用Blast2go软件对这些差异表达基因进行GO分类。从总库中挑选38个基因进行RT-PCR验证,最后选择4SR(Abscisic acid,Stress and Ripening)基因作为研究的对象。  ASR基因在果实成熟,花粉成熟和葡萄糖代谢等发育过程高度累积,并且响应水分缺失,盐胁迫,低温,缺少光照,病害等胁迫,但它们的确切功能和作用机制仍然未知。  本研究从狗牙根的叶片中克隆了CdASR基因,该基因全长615bp,包含一个408bp的开放阅读框,编码一条135aa的肽链。通过序列比对发现CdASR与其他物种中的ASR基因具有很高的同源性。CdASR中含有一个ABA WDS(Water Deficit Stress)保守域。在CdASR的氨基端含有一组组氨酸,在羧基端含有一段核定位信号肽。本研究通过把CdASR和绿色荧光蛋白融合表达,发现CdASR定位在核和细胞质中。Southern杂交显示,CdASR在狗牙根中为单拷贝。通过荧光定量PCR分析确认了外源ABA诱导CdASR的表达。在干旱和盐胁迫的情况下,CdASR快速响应,表达量明显上升,但在低温(4℃)下处理不同时间后的CdASR表达差异不显著。  本研究构建了CdASR的超表达和干涉载体,通过农杆菌介导法转化水稻(中花11),已获得22株超表达CdASR的植株和22株干涉ASR的植株,检测均为阳性。有两株超表达植株Southern杂交检测,一株是单拷贝,另一株是双拷贝,潮霉素筛选后均出现接近3:1的分离比,用T1代植株进行抗逆性分析,在盐、干旱、低温条件下,超表达CdASR的植株都表现出更强抗逆性。  
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