论文部分内容阅读
目的:我国是食管癌的高发国家,特别是河北省南部与河南省北部,食管癌病死率为全球最高的地区之一。现已公认,早期发现、早期诊断、早期治疗是提高食管癌生存率的主要措施,但早期癌发病隐匿,不易发现,是食管癌患者不能及时治疗的主要原因。近年来,随着恶性肿瘤发生的分子生物学机制研究的进展,认为恶性肿瘤的发生主要涉及两大机制:一是遗传学机制,即:DNA序列的异常改变。另一个是表遗传学机制,即DNA的基因外修饰,其主要形式是甲基化改变。基因的异常甲基化,即抑癌基因的高甲基化与癌基因的去甲基化被认为是抑癌基因失活和癌基因激活的主要机制。与突变等基因改变不同,基因的甲基化状态是可逆的,这对肿瘤的防治尤为重要。p73和PTEN基因是两种重要的肿瘤抑制基因,可通过不同的方式调控细胞周期、抑制细胞增殖及诱导凋亡,参与肿瘤的发生、发展。有研究表明p73基因G4C14-A4T14、-386G/A和PTEN基因-9C/G、IVS4-/+多态性与多种肿瘤和其它疾病的易感性有关;而p73和PTEN基因的高甲基化也在许多肿瘤的形成中起重要作用。因此本研究首先分析p73基因G4C14-A4T14、-386G/A和PTEN基因-9C/G、IVS4-/+多态性在河北省食管癌高发区正常人群和食管癌患者中的分布,探讨其与食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)易感性的关系;其次检测食管癌组织中p73和PTEN基因的甲基化状态,分析其与ESCC生物学行为的关系;进一步检测食管癌组织中p73和PTEN基因mRNA表达情况及其临床意义。分别从遗传学角度—基因多态性、表遗传学角度—基因甲基化、转录水平—基因mRNA表达,来阐述p73和PTEN基因在食管癌发生中的作用,探讨个体对食管癌的易感机制和食管癌发生、发展的分子机制,为食管癌的预防和治疗提供理论依据。方法:1.采用基于人群的病例-对照研究方法,收集河北省磁县和涉县348例食管癌患者和624例健康对照个体的静脉抗凝血,同时记录其病史、个人史、肿瘤家族史。以蛋白酶K消化-饱和氯化钠盐析法提取外周血白细胞DNA,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)方法检测ESCC患者和健康对照者的p73 G4C14-A4T14、-386G/A和PTEN -9C/G、IVS4–/+多态的基因分型。以非条件Logistic回归法计算经年龄、性别及吸烟状态、家族史校正的相对风险度的比值比(odds ratio, OR)及其95%可信区间(95% confidence interval, 95%CI)。2.收集94例ESCC患者的食管病变组织及94例ESCC患者相应的食管正常组织,采用酚氯仿法抽提组织DNA并进行亚硫酸盐处理,采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation specific PCR, MSP)的方法,对其分别进行p73和PTEN基因启动子区的甲基化状态检测,分析其与食管癌发病、淋巴结转移、浸润深度、及临床病理分期的关系。3.应用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription PCR, RT-PCR)方法检测94例ESCC肿瘤组织及相应正常组织的p73和PTEN基因mRNA表达情况,采用相对定量分析计算各组基因表达相对系数的均数(x±s),并分析其与食管癌发病、淋巴结转移、浸润深度、及临床病理分期的关系。4.采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)方法检测94例ESCC患者p73 G4C14/A4T14和PTEN IVS4-/+多态的基因型。采用MSP的方法检测ESCC组织p73和PTEN基因启动子区的甲基化状态;同时应用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription PCR, RT-PCR)方法定性检测ESCC组织p73和PTEN基因mRNA表达。分析p73 G4C14/A4T14和PTEN IVS4-/+多态性与其基因mRNA表达关系;分析p73和PTEN基因启动子区的甲基化状态与其基因mRNA表达关系。结果:1. ESCC患者组中上消化道肿瘤(upper gastrointestinal cancers, UGIC)家族史阳性者的比例(46.6%)显著高于健康对照组(34.9%),两者相比有显著性差异(χ2 = 12.66, P = 0.00)。UGIC可显著增加ESCC患者的发病风险(经性别、年龄、吸烟状况校正的OR=1.64,95%CI=1.25~2.15)。2.健康对照组p73 GC/GC、GC/AT和AT/AT基因型频率分别为62.0%、33.3%和4.7%;GC和AT等位基因频率分别为78.9%和21.1%。ESCC组与健康对照组相比在基因型、等位基因的分布上无显著性差异(P>0.05)。与GC/GC基因型相比,GC/AT和AT/AT基因型不改变食管癌的发病风险,经年龄、性别、吸烟状况校正的OR值分别为0.98(95%CI=0.74-1.31)和1.31(95%CI=0.72-2.37)。根据吸烟状况和UGIC家族史进行了分层分析,结果显示在吸烟者、非吸烟者中p73 GC/AT和AT/AT基因型均不影响ESCC的发病风险;同样在UGIC家族史阳性和阴性个体中GC/AT和AT/AT基因型也不影响ESCC的发病风险。3. p73 -386G/A SNP对照组G/G、G/A和A/A基因型频率分别为18.9%、54.0%和27.1%;G和A等位基因频率分别为45.9%和54.1%。ESCC组与健康对照组相比在基因型、等位基因的分布上无显著性差异(P>0.05)。与A/A基因型相比,G/A和G/G基因型不改变食管癌的发病风险,经年龄、性别、吸烟状况校正的OR值分别为0.91(95%CI=0.66-1.24)和1.23(95%CI= 0.83-1.82)。根据吸烟状况和UGCI家族史进行分层分析显示,与A/A基因型相比,G/A和G/G基因型不影响吸烟个体、非吸烟个体及UGIC家族史阳性者、阴性者ESCC的发病风险。4.健康对照组中PTEN -9C/G基因型分布分别为C/C 87.7%、C/G 11.7%、G/G 0.6%;其中C等位基因为93.5%,G等位基因为6.5%。ESCC组与健康对照组相比在基因型、等位基因的分布上无显著性差异(P>0.05)。与C/C基因型相比,携带G等位基因(C/G+G/G)不改变食管癌的发病风险,校正的OR值为1.11(95%CI = 0.75-1.64)。根据吸烟状况和UGCI家族史进行分层分析显示,与C/C基因型相比,携带G等位基因(C/G+G/G)既不改变吸烟人群、非吸烟人群ESCC发病风险,也不改变UGIC家族史阳性个体、阴性个体ESCC发病风险。5. PTEN IVS4-/+多态在对照组中基因型分布分别为-/- 21.9%、-/+ 52.1%和+/+ 26.0%;–等位基因(非插入型)频率为48.0%,+等位基因(插入型)频率为52.0%。而在病例组中-/-、-/+、+/+基因型频率分别为26.7%、52.3%和21.0%;-和+等位基因频率分别为52.9%和47.1%。病例组与对照组相比,-/-和+/+基因型分布存在差异(χ2=4.45,P=0.04),并且两组的等位基因型分布也存在差异(χ2=4.25,P=0.04)。与-/-基因型相比,+/+基因型降低食管癌的发病风险,经年龄、性别、吸烟状况校正的OR值为0.66(95%CI = 0.45-0.97),而-/+基因型则不改变食管癌的发病风险。分层分析显示,与-/-相比-/+基因型显著降低UGIC家族史阳性个体患食管癌的风险,校正的OR值为0.56(95%CI = 0.34-0.92)。6.用2LD软件分析p73和PTEN两个位点的连锁情况,结果显示p73 G4C14-A4T14和-386G/A的两个位点不存在连锁不平衡,D’=0.34;而PTEN -9C/G和IVS4-/+两个位点则处于部分连锁不平衡,D’=0.72。PTEN -9C易与IVS4+连锁。7.用EH软件分别对p73和PTEN的两个位点进行单体型计算,结果显示p73 G4C14-A4T14和-386G/A构成的单体型,在健康对照中以G4C14/-386A单体型最为常见,占42.6%。各单体型分布在ESCC组和健康对照组中没有显著性差异(P>0.05);与G4C14/-386A单体型相比G4C14/-386G、A4T14/-386A和A4T14/-386G单体型均不增加食管癌的发病风险。在PTEN -9C/G和IVS4-/+构成的单体型中,-9C/IVS4+是健康对照中最常见的单体型,占48.6%。在ESCC组和健康对照组中单体型-9C/IVS4+和-9C/IVS4-的分布存在差异(χ2=3.95,P=0.047);与-9C/IVS4+单体型相比单体型-9C/IVS4-增加食管癌的发病风险,OR值为1.22(95%CI= 1.003-1.47)。8.对p73 G4C14-A4T14和PTEN IVS4 -/+多态进行联合分析显示,与p73 GC/GC–PTEN-/-基因型组合相比,p73 GC/GC–PTEN-/+组合、p73 GC/GC–PTEN+/+组合、p73 GC/AT+AT/AT–PTEN-/-组合、p73 GC/AT+AT/AT–PTEN-/+组合及p73 GC/AT+AT/AT–PTEN+/+组合均不能增加ESCC的发病风险(P>0.05)。9. p73和PTEN基因的甲基化状况与患者的性别、年龄、吸烟状况、上消化道肿瘤家族史均无关(P>0.05)。94例食管浸润癌中p73基因和PTEN基因的甲基化频率分别为12.8%和45.7%;对94例浸润癌患者同一个体相应的病变周围的正常组织行甲基化检测,7例(7.4%)发生p73基因的甲基化,11例(11.7%)发生PTEN基因的甲基化。p73基因甲基化在食管癌组织中与食管正常组织中相比无显著性差异(P=0.23);而PTEN基因的甲基化在食管癌组织中显著高于食管正常组织(P=0.00)。10.在94例ESCC浸润癌中,淋巴结转移阳性组和阴性组p73基因甲基化频率分别为14.3%和11.9%,两组相比,p73甲基化状态无显著性差异(P=0.98);淋巴结转移阳性组和阴性组PTEN基因甲基化频率分别为62.9%和35.6%,阳性组PTEN基因甲基化频率显著性高于阴性组(P=0.01)。11.在94例ESCC浸润癌中,浸润深度T1+T2组和T3+T4组p73基因甲基化频率分别为8.0%和14.5%,两组相比,p73基因甲基化状态无显著性差异(P=0.63);T1+T2组和T3+T4组PTEN基因甲基化频率分别为56.0%和42.0%,两组相比,PTEN基因甲基化频率无显著性差异(P=0.23)。12.在94例浸润癌中,Ⅰ+Ⅱ期组和Ⅲ+Ⅳ期组p73基因甲基化频率分别为11.3%和15.6%,两组相比,p73基因甲基化频率无显著性差异(P=0.79);Ⅰ+Ⅱ期组和Ⅲ+Ⅳ期组PTEN基因甲基化频率分别为40.3%和56.3%,两组相比,PTEN基因甲基化频率无显著性差异(P=0.14)。13. p73和PTEN mRNA表达与患者的性别、年龄无关(P>0.05)。94例食管浸润癌中,p73基因和PTEN基因的mRNA表达平均值分别为0.73±0.38和0.63±0.30;94例相应的病变周围的正常组织中,p73基因和PTEN基因的mRNA表达平均值分别为0.62±0.34和1.33±0.56。食管肿瘤组织p73基因mRNA表达高于正常组织,P=0.04;而食管肿瘤组织PTEN基因mRNA表达明显低于正常组织,P=0.00。p73和PTEN mRNA表达在食管肿瘤组织与正常组织中存在显著性差异。14. 94例ESCC浸润癌中,区域淋巴结转移阳性组和阴性组p73基因mRNA表达量分别为0.67±0.39和0.77±0.37,两组相比,p73基因mRNA表达无显著性差异(P=0.22);淋巴结转移阳性组和阴性组PTEN基因mRNA表达量分别为0.66±0.30和0.59±0.30,两组相比,PTEN基因mRNA表达无显著性差异(P=0.32)。15. 94例ESCC浸润癌中,浸润深度T1+T2组和T3+T4组p73基因mRNA表达量分别为0.83±0.40和0.69±0.37,两组相比,p73基因mRNA表达无显著性差异(P=0.14);T1+T2组和T3+T4组PTEN基因mRNA表达量分别为0.64±0.30和0.63±0.30,两组相比,PTEN基因mRNA表达无显著性差异(P=0.82)。16. 94例ESCC浸润癌中,临床病理分期Ⅰ+Ⅱ期组和Ⅲ+Ⅳ期组p73基因mRNA表达量分别为0.78±0.38和0.62±0.37,两组相比,p73基因mRNA表达在Ⅰ、Ⅱ期高于Ⅲ、Ⅳ期,但处于临界意义(P=0.05);Ⅰ+Ⅱ组和Ⅲ+Ⅳ期组PTEN基因mRNA表达量分别为0.65±0.30和0.59±0.30,两组相比,PTEN基因mRNA表达无显著性差异(P=0.32)。17.对94例ESCC患者进行p73 G4C14-A4T14和PTEN IVS4-/+基因分型,结果显示,p73 G4C14-A4T14基因型分布为GC/GC 59例(62.8%)、GC/AT 30例(31.9%)、AT/AT 5例(5.3%);PTEN IVS4-/+基因型分布为-/- 27例(28.7%)、-/+ 49例(52.1%)、+/+18例(19.2%)。18.本组研究对象中,携带p73 GC/GC基因型个体p73 mRNA表达阳性者为35例(59.3%),表达阴性者为24例(40.7%);携带p73GC/AT或AT/AT基因型个体p73 mRNA表达阳性者为21例(60.0%),表达阴性者为14例(40.0%)。p73 GC/AT+AT/AT基因型与GC/GC基因型相比p73 mRNA表达无显著性差异(P=0.95)。携带PTEN -/-基因型个体PTEN mRNA表达阳性者为18例(66.7%),表达阴性者为9例(33.3%);携带PTEN -/+基因型个体PTEN mRNA表达阳性者为35例(71.4%),表达阴性者为14例(28.6%);携带PTEN +/+基因型个体PTEN mRNA表达阳性者为10例(55.6%),表达阴性者为8例(44.4%)。PTEN IVS4-/+各基因型间PTEN mRNA表达无显著性差异(P=0.47)。19.本组研究对象中,56例p73 mRNA表达阳性的ESCC肿瘤组织中,7例(12.5%)出现p73基因的甲基化,而38例p73 mRNA表达阴性的肿瘤组织中,5例(13.2%)发生了p73基因的甲基化,食管癌肿瘤组织中的p73基因mRNA表达与其甲基化状态无显著的相关性(Phi=-0.01, P=0.93)。63例PTEN基因mRNA表达阳性的ESCC肿瘤组织中,20例(31.7%)发生了PTEN基因的甲基化,而31例PTEN mRNA表达阴性的肿瘤组织中,23例(74.2%)出现PTEN基因的甲基化。在PTEN mRNA失表达个体中,PTEN基因的甲基化频率显著升高。显示食管癌肿瘤组织中PTEN基因mRNA的失表达与其甲基化状态有显著的相关性(Phi=-0.40, P=0.00)。结论:1.上消化道肿瘤家族史明显增加河北省食管癌高发区人群ESCC的发病风险。2.与p73 GC/GC基因型相比,p73 GC/AT和AT/AT基因型均不影响中国河北省食管癌高发区人群ESCC的发病风险。同样,与p73 -386A/A基因型相比,p73 -386G/A和-386G/G基因型也不影响该地区人群ESCC的发病风险。3. p73 G4C14-A4T14和-386G/A多态位点不存在连锁不平衡。与G4C14/-386A单体型相比,G4C14/-386G、A4T14/-386A和A4T14/-386G单体型不影响食管癌高发区人群ESCC的发病风险。4.与PTEN -9C/C基因型相比,携带G等位基因(即G/C+G/G基因型)不影响中国河北省食管癌高发区人群ESCC的发病风险。然而与PTEN IVS4-/-基因型相比,PTEN IVS4+/+基因型可以降低该地区人群ESCC的发病风险,是食管癌发生的保护性因素。5. PTEN -9C/G和IVS4-/+多态位点存在部分连锁不平衡,-9C等位基因与IVS4+等位基因部分连锁。与-9C/IVS4+单体型相比,-9C/IVS4-单体型增加中国河北省食管癌高发区人群ESCC的发病风险。6. p73 G4C14-A4T14和PTEN IVS4-/+多态性在河北省食管癌高发区人群ESCC发病过程中没有协同作用。7.食管癌组织中p73基因的高甲基化频率较低,其基因的高甲基化与食管癌的发生无关。并且p73基因的高甲基化与食管癌组织的浸润深度、临床病理分期及淋巴结转移无关。提示p73基因的甲基化不是食管癌发生、发展的主要事件。8.食管癌组织中PTEN基因的高甲基化频率较高,并且其基因的高甲基化与食管癌的发生密切相关。虽然,PTEN基因的甲基化状况与食管癌组织的浸润深度、临床病理分期无关,但是,PTEN基因甲基化与食管癌的淋巴结转移密切相关,淋巴结转移阳性组PTEN基因甲基化频率显著性高于淋巴结转移阴性组,提示PTEN基因高甲基化可能与食管癌的预后不良有关。9. p73基因mRNA高表达可能在食管癌上皮癌变过程中起作用,而PTEN基因的低表达可能与食管癌发生密切相关。p73和PTEN基因的mRNA表达与食管癌淋巴结转移、食管癌侵及深度、临床病理分期均无关。10.在食管癌中,p73 G4C14-A4T14和PTEN IVS4-/+多态性与其基因mRNA表达无关,提示这两个多态可能不影响其基因表达。11.食管癌中,p73mRNA表达与其基因甲基化状况无关;在PTEN基因失表达个体中,PTEN基因甲基化频率显著升高,PTEN mRNA失表达与其基因甲基化密切相关,提示PTEN基因甲基化引起其mRNA失表达,进而导致食管癌的发生。