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背景和目的脊髓损伤是由各种原因引起的脊髓结构和功能的损伤,造成损伤平面以下运动、感觉、括约肌及植物神经功能等障碍,引起的并发症多,致残率高,目前还没有有效的治疗方法。这主要是因为脊髓损伤后中枢神经系统微环境恶劣,不利于受损轴突的再生。因此,如何改善脊髓损伤后的不良微环境、提高脊髓中枢神经再生能力,是治疗脊髓损伤的关键。很多实验证实,低频电磁场具有促进细胞的增殖、生长和分化；减轻炎症水肿、缓解疼痛；促进组织再生和减少细胞凋亡的作用。近来研究还发现,低频电磁场可以明显改善猫和大鼠脊髓损伤模型的运动功能,该作用与低频电磁场加快受损神经的再生过程,并影响生长因子活性和表达水平从而有利于轴突运输和神经突的再生有关。随着干细胞研究的深入,发现干细胞可在组织修复过程中发挥重要的作用。其中骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells, BMSC)具有多能干细胞特性,可以分化为骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等细胞。研究已经证实,在体内外骨髓来源的细胞能形成神经细胞系。而且研究者使用BMSC用于治疗脊髓损伤,结果发现BMSC移植有助于提高肢体运动功能的恢复。我们课题组前期的研究显示,低频电磁场不仅可以促进体外培养的骨髓间充质干细胞的增殖而且还具有促进其向功能性神经元分化的作用。然而,低频电磁场是否有助于改善脊髓损伤局部微环境及有助于BMSC移植修复脊髓损伤大鼠从而促进其运动功能的恢复,国内外尚未见相关报道。因此,本实验构建不完全性脊髓损伤大鼠模型,探讨低频电磁场在移植骨髓间充质干细胞大鼠脊髓损伤模型运动功能恢复中的作用。方法采用全骨髓培养法分离培养大鼠BMSC,观察原代及传代细胞的形态及生长特点；采用流式细胞术检测细胞表面标志物和细胞周期对培养的BMSC进行鉴定。将第3-5代BMSC作为种子细胞,BrdU进行标识后用于移植。采用脊髓压迫法构建64只SD大鼠T1o不完全性脊髓损伤模型,并随机分成四组即对照组、BMSC组、EMF组和EMF+BMSC组,每组16只大鼠,造模后按时间点不同又分为3、7、14和21天四个亚组,每个亚组4只大鼠。脊髓损伤后30分钟内,用微量注射器将BrdU标记的BMSC悬液注入到BMSC组和EMF+BMSC组大鼠脊髓损伤区头、尾侧脊髓实质内。脊髓损伤24小时后,将EMF组和EMF+BMSC组大鼠暴露在低频电磁场(频率为50Hz,强度为5mT)中,每天60分钟,每天1次,连续作用21天；对照组和BMSC组置于无低频电磁场的同样的环境中观察。术前及术后第3、7、14和21天,将各组大鼠置于90cm x120cm开放空间内,双人、双盲采用Basso-Beattie-Bresnahan (BBB)运动评分标准对大鼠后肢运动功能观察和评分并对其进行统计学分析。分别在第3、7、14和21天时每组处死4只大鼠留取标本,HE染色观察各组损伤脊髓组织病理学变化情况；免疫组织化学法分析研究BrdU阳性BMSC在脊髓损伤区的生存情况；免疫荧光法检测GFAP、MMP-2和BrdU阳性BMSC在脊髓损伤区的表达情况。结果1.利用脊髓压迫法造模后立即出现一过性鼠尾痉挛性摆动和双下肢抽动,术后1小时麻醉清醒后大鼠BBB评分为0-2分;同时大脑皮层体感诱发电位显示P1、N、P2波的峰潜伏期(Lat)延长,幅度几乎为正常的2倍,说明成功构建了不完全性脊髓损伤模型。2.分离BMSC后进行培养,BMSC形成细胞团簇,有较多突起,细胞呈现梭形外观。流式细胞术细胞表面标志物鉴定提示培养的BMSC高表达CD90、 CD29、CD44和CD73,而低表达CD45。第3代BMSC中G0/G1期的细胞为82.0%,G2期的细胞为1.46%,S期的细胞为16.5%,大部分细胞处于静止期,只有少数的细胞处于活跃的增殖期,符合干细胞特征。3.各脊髓损伤模型实验前BBB评分结果无统计学差异；实验后经重复测量方差分析,结果显示组间存在差异(F=36.755,P=0.000),四种不同处理的大鼠BBB评分差异有统计学意义；不同时间点间也存在差异(F=374.025,P=0.000),各组BBB评分变化与时间变化有关。实验处理方法与时间之间有交互作用(F=7.471,P=0.000),提示处理因素随时间的增加,BBB评分变化趋势不同,EMF+BMSC组变化明显。进一步分析单独效应结果显示,第3天时各组大鼠后肢运动功能的BBB评分差异无统计学意义(F=1.941,P=0.177),其余各时间点内各组间比较差异均有统计学意义(P均=0.000)。7天时,各组BBB评分均有提高,四组之间BBB评分差异有统计学意义(F=13.918,P=0.000),但对照组与EMF组之间和BMSC组与EMF+BMSC组之间的BBB评分差异无统计学意义,分别为(P=0.240和P=0.472)。14天时,对照组与BMSC组比较差异有统计学意义(P=0.000),对照组与EMF组比较差异有统计学意义(P=0.001),对照组与BMSC+EMF组比较差异有统计学意义(P=0.000)；EMF组和BMSC组比较差异有统计学意义(P=0.035),EMF组和BMSC+EMF组比较差异有统计学意义(P=0.004)；但BMSC组和EMF+BMSC组之间BBB评分差异无统计学意义(P=0.258)。21天时,对照组与BMSC组比较差异有统计学意义(P=0.000),对照组与EMF组比较差异有统计学意义(P=0.000),对照组与BMSC+EMF组比较差异有统计学意义(P=0.000)；EMF组和BMSC组比较差异有统计学意义(P=0.009),EMF组和BMSC+EMF组比较差异有统计学意义(P=0.000)；BMSC组和EMF+BMSC组之间BBB评分差异有统计学意义(P=0.005)。提示BMSC移植和EMF治疗均可改善大鼠脊髓损伤模型的运动功能,两者相比BMSC组效果较明显；但低频电磁场干预和BMSC移植共同作用于脊髓损伤模型时,与其他实验组相比较,EMF+BMSC组大鼠脊髓损伤模型后肢运动功能的恢复更快更好。4.术后第3天各组大鼠损伤脊髓组织结构紊乱,局部有出血、水肿和坏死细胞形成。第7天,对照组和EMF组脊髓组织结构破坏严重,损伤区有较多坏死液化吸收后形成的囊性空洞,神经细胞明显减少且变性、肿胀较重,周围有炎性细胞浸润,组织进一步肿胀,血流减少；BMSC组和EMF+BMSC组损伤区囊性空洞面积较小、肿胀稍减轻,可见肥大的巨噬细胞和胶质细胞等,组织结构仍比较模糊。随着时间变化,各组脊髓组织结构逐渐改善,第14天,除了对照组外,其他三组囊性空洞几乎闭合,被其它细胞组织所代替填充,BMSC组组织水肿消失,仅有少量炎细胞浸润,EMF+BMSC组脊髓损伤结构已大部分修复,细胞排列有序,炎细胞基本消失。术后第21天,除对照组外,其他各组损伤脊髓组织结构基本修复。5.第14天和21天时,对照组脊髓损伤区可见大量的GF:AP阳性蛋白；EMF组和BMSC组可见中等量GFAP阳性蛋白分布于损伤区周围；EMF+BMSC组GFAP阳性蛋白最少.BMSC组和EMF+BMSC组的脊髓组织在BMSC移植后第7天,局部组织MMP-2的表达量开始升高,14天最明显。术后3-21天,BMSC组和EMF+BMSC组损伤脊髓组织中都可观察到BrdU阳性细胞,并与组织融合生长,EMF+BMSC组BrdU阳性细胞生长情况较好,对照组和EMF组无BrdU阳性细胞。结论1.利用脊髓压迫法成功构建脊髓损伤动物模型,具有重复性好、操作简单的特点。2.经全骨髓培养法可分离出纯度较高的大鼠骨髓间充质干细胞,移植后可在大鼠脊髓损伤模型中存活。3.低频电磁场不仅可以改善大鼠脊髓损伤模型的运动功能,也能促进BMSC移植大鼠脊髓损伤模型的修复。