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黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)引起的番茄病毒病十分普遍和严重，已经成为影响番茄产量和品质的最主要病害之一。在我国，每年CMV造成的番茄产量损失占总产量15％以上。迄今为止，尚未形成防御CMV侵染的有效策略。由于植物缺乏天然的抗CMV基因，常规育种方法不能满足生产上的需要。近几年植物基因工程和分子生物学的快速发展，为揭示植物．病原互作的分子机制开辟了新途径。基因芯片技术是近年来发展的，它结合植物物种的基因组信息和大量EST(expressedsequence tag)序列，使其在对植物病原体相关的防御反应研究方面体现出高通量特点。最近研究表明，病毒侵染能够影响植物调控作用的小分子microRNA(miRNA)的表达。本文利用番茄基因组信息、CMV基因组信息和植物miRNA序列信息，分别构建了番茄-CMV基因表达谱芯片和植物miRNA检测芯片，分别进行CMV侵染引起的番茄基因表达和番茄保守性miRNA确认及其与CMV侵染关系的研究。
番茄-CMV基因表达谱芯片构建与应用。本研究利用TIGR数据库的番茄TC序列和本实验室分离获得的CMV-phy及卫星RNA-Rs的序列信息，设计了37～45 mer长度的探针，采用μParafloTM技术原位合成31×128矩阵的第一代番茄-CMV基因表达谱芯片(包含3311条非重复番茄TC序列探针、242条CMV-phy序列探针和14条卫星RNA-Rs序列探针)。为了消除番茄与CMV/卫星RNA之间的交叉杂交现象，本研究首先采用Cy3-dUTP和Cy5-dUTP双色荧光标记健康番茄的总RNA和CMV转录RNA并与芯片杂交。结果表明：38个CMV/卫星RNA探针与番茄基因组产生杂交信号，20个番茄探针与CMV基因组产生杂交信号。因此，重新设计合成第二代芯片，应用第二代芯片研究了受CMV侵染7天的番茄和健康对照的叶组织中基因表达变化，结果显示：其一，与健康对照相比，共有100个番茄基因发生了差异表达，其中52个基因表达上调，48个表达下调。根据差异表达基因的功能分析表明这些基因与细胞挽救/防御/毒性、新陈代谢、能量、蛋白折叠/修饰/定位、蛋白合成、细胞转运、信号传导、转录、结合相关等密切相关，另有部分基因功能未知。其二，系统侵染的番茄叶组织中CMV基因组正义链的拷贝数远远大于负义链，并且三条正义链的表达量为RNAl序列，去除冗余序列共产生了165条LJnqiue miRNA序列和365条Unique miRNA<*>序列，此外，我们还设计了其他一些非编码小分子RNA探针(ncRNA、tRNA和rRNA)作为内参照。应用构建的植物miP(NA检测芯片，我们获得了番茄miRNA并研究了其在CMV侵染中的表达情况。Northern杂交验证了部分芯片实验结果。通过芯片杂交实验，我们获得了56条番茄保守性miRNA，它们分属于11个miRNA家族，其中9个miRNA家族在所研究的番茄生长过程中发生了差异性表达。CMV侵染的时序表达实验显示，病毒侵染引起了32个Unique miRNA和17个UniquemiRNA<*>的差异性表达。聚类分析显示在CMV侵染20 d时miRNA明显的呈现出上调和下调两大类。我们设计合成的植物miRNA检测芯片是迄今为止，对于番茄保守性miRNA最广泛的一次调查，并且CMV侵染实验为进一步研究这一经济作物的抗病机制提供了新的分子信息。