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枯草芽孢杆菌具有安全性好、产酶种类全、蛋白酶活力高,培养设备条件要求低、耗能低、菌体细胞繁殖量高等优点,在许多生产领域中得到应用,由于它的糖化酶活力较低,因而影响了该菌的应用范围和使用效果。黑曲霉UV-11是一株糖化酶高产菌株,但它的酶系单一,并且由于霉菌的性质使得它在许多生产领域中无法应用。本实验通过He-Ne激光-PEG复合诱导枯草芽孢杆菌(简称MC7)及黑曲霉UV-11(简称UV-11)原生质体融合,选育出一株具有高糖化酶和蛋白酶活力的枯草芽孢杆菌新菌株。
本实验首先通过正交实验确定了制备双亲原生质体的最佳条件:MC7原生质体是在溶菌酶浓度为1mg/mL,37℃下酶解1.5h;UV-11原生质体是在溶壁酶浓度为1.5mg/mL,34℃下酶解2h。
本实验对双亲原生质体进行单激光诱变,结果表明:对MC7原生质体激光照射4min时,正变率最高,为34.7%;对UV-11原生质体激光照射4min,正变率最高,为38.2%。
聚乙二醇(PEG)诱导双亲原生质体融合的最佳条件为:PEG浓度为40%,在50℃下融合4min,融合率达到最高为5.1×10-6。激光诱导双亲原生质体融合的最佳照射时间为4min,融合率达到最高为8.5×10-6。聚乙二醇与激光复合诱导原生质体融合,照射时间为4min时,融合率达到最大,为10.2×10-6。测定结果表明,所选枯草芽孢杆菌融合子的糖化酶活大部分均有所提高,其中激光照射4min时,融合子4-5#菌株的糖化酶活最高,达到28.5U/mL,是亲本MC7糖化酶活的230.6%,同时它的蛋白酶活为386.4U/mL,是亲本MC7蛋白酶活的107.8%。
通过酯酶同工酶谱技术分析,对融合子与双亲菌株相比较,证实了融合子遗传物质发生了遗传重组,其产糖化酶能力显著提高,并且蛋白酶活力也较高。通过传代培养,融合子遗传稳定性良好。