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颅神经嵴向腹外侧迁移到达颌突的中胚层以后，就被称为“外胚间充质”。神经嵴源性的外胚间充质干细胞具有可塑性，可分化为骨、软骨、牙本质和牙髓等多种组织，因此，在颅面和牙齿发育过程中起着重要的作用。外胚间充质干细胞在体内经过多步的分化，最终分化为分泌矿化基质的高柱状的成牙本质细胞。在这个过程中，有许多细胞外基质分子、信号分子、生长因子(如：FGF、IGF、TGF等)和它们受体的精确调控，而且，精确的细胞-细胞、细胞-基质、基质-基质交互作用有利于促进成牙本质细胞的分化以及对基质钙化起关键作用成分的合成。研究者已经注意到在成牙本质细胞分化调节过程中的几种调节因子及其与上皮源性成釉细胞间复杂的相互作用。 DSPP基因(表达DPP和DSP两种蛋白)，基本上是牙本质矿化所独有，目前虽然有报道显示在大鼠长骨中有少量DSPP表达，但大多数学者仍将DSPP作为成牙本质细胞活性的特异性表面标志。 本研究采用细胞培养、免疫组化、原位杂交以及RT-PCR等实验手段，以DSPP基因、DSP蛋白作为成牙本质细胞的特异性标志，通过体内体外实验诱导大鼠颌突外胚间充质干细胞向成牙本质细胞样细胞的分化，为进一步阐明牙齿发育和牙体牙髓损伤修复机制以及组织工程牙齿的研究提供实验和理论依据。 实验共分三部分： 第四军医大学博士学位论文 1．SD大鼠颔突外胚间充质干细胞的体外培养和鉴定 采用差异消化贴壁法分离和纯化培养SD大鼠颌突外胚间充质干细胞；倒置显微镜观察细胞生长特性；免疫组化法鉴定细胞来源。结果，细胞里成纤维细胞样细胞生长，状态稳定。免疫组化染色显示细胞表达HNK．l、VIM、S上 和NSE，而GFAP、NF、CK和Vlll因子为阴性。从而证明培养的细胞为外胚间充质干细胞，为定向诱导分化研究提供了实验基础。 2．hFGF和！GFl诱导大鼠颌突外胚间充质干细胞向成牙本质细胞样细胞分化 L＊ bFGF和 IGFl对大鼠外胚间充质干细胞增殖活性和碱性磷酸酶活性的影响。 采用MH比色法和ALPase细胞免疫化学法检测bFGF和（或只GFJ刺激后，大鼠外胚间充质干细胞的增殖活性和ALPase活性。结果显示：bFGF和IGF－l刺激组和IGF刺激组细胞增殖活性与对照组无明显差异，而bFGF刺激组明显高于对照组；但是对于ALPase活性，bFGF和IGF1刺激组和IGF刺激组明显高于对照组，而bFGF和 IGF－l刺激组又明显高于IGF刺激组，bFGF刺激组则与对照组无明显差异。因此认为bFGF可促进大鼠外胚间充质干细胞的增殖，bFGF和 IGF－l可能协同促进其分化。这可为其诱导分化研究提供参考。 2．2 bFGF和！GF’4诱导大鼠外胚间充质干细胞向成牙本质细胞样细胞分化。 ＊2司在培养液中加入bFGF和（或n 刺激大鼠外胚间充质干细胞，结果显示：在bFGF和IGF－l刺激组，细胞生长状态好，胞浆突起变长，免疫组化显示数量较多的细胞表达DSP，IGFI刺激组中只有少量细胞形成较为典型的成牙本质细胞样形态，而且部分细胞表达DSP，而bFGF组和对照组没有出现成牙本质细胞样细胞表型。 2．2二在平面培养的基础上，以胶原作为支架，建立大鼠颌突外胚间充质干细胞三维诱导培养模型，采用免疫组化、原位杂交、RT．PCR和von Kossa 3 第四军医大学博士学位论文染色等手段从形态学和表型鉴定显示：bFGF和IGF诱导组细胞出现单极胞浆突起，而且平行排列，且表达 DSP、DMP、DPP mANA和 DSPP，矿化液诱导培养Zld后，细胞形成矿化结节。然而其余组没有出现成牙本质细胞样细胞表型。 以上实验证实bFGF和IGFI可诱导大鼠颌突外胚间充质干细胞向成牙本质细胞样细胞的分化。为研究牙齿发育和牙体牙髓损伤的分子机制奠定了基础。 3．bFGF和！GF＊诱导大鼠颌突外胚间充质干细胞向成牙本质细胞样细胞分化的体内实验 将经过不同因子诱导的细胞与珊瑚和牙本质陶瓷粉复合后分别植人大鼠和裸鼠皮下，在一定时间后取材，经HE染色、Mallory改良三色法和免疫组化显示：经bFGF和IGF－l诱导的细胞可形成少量的钙化基质，而其余组均未出现基质沉积。这可为组织工程牙齿种子细胞的来源和支架材料的选择提供参考。