论文部分内容阅读
目的：1．通过内毒素（lipopolysaccharide，LPS）刺激实验，观察LPS对正常皮肤成纤维细胞增殖和胶原合成等生物学特性的影响，探讨LPS在早期创面愈合中的可能作用。2．使用特定浓度LPS刺激正常皮肤成纤维细胞后连续传代，观察其形态学、生物学特性及基因表达谱改变，并与自身增生性瘢痕组织成纤维细胞进行比较，探讨LPS对后期瘢痕形成的影响及可能机制。方法：随机选取增生性瘢痕患者20例（处于增生期），取其瘢痕组织及正常皮肤，采用组织块法行成纤维细胞原代培养。对纯化至第3代的正常皮肤成纤维细胞用不同浓度的LPS（E. coli055：B5）进行刺激，实验分组如下：（1）0.000ug/ml LPS刺激组（阴性对照组）；（2）0.005ug/ml LPS刺激组；（3）0.010ug／ml LPS刺激组；（4）0.050ug／ml LPS刺激组；（5）0.100ug/ml LPS刺激组；（6）0.500ug／ml LPS刺激组；（7）1.000ug/ml LPS刺激组。采用下列方法检测成纤维细胞生物学特性（细胞增殖和胶原合成）：细胞计数法、MTT比色法及细胞增殖周期检测成纤维细胞增殖活性，3H-脯氨酸掺入、胃蛋白酶消化法检测成纤维细胞内胶原合成量，将LPS刺激作用最为明显组成纤维细胞进行连续传代培养，采用透射电镜观察（第4、6、8、10代）成纤维细胞超微结构的变化，其中自第8代开始成纤维细胞超微结构与自身增生性瘢痕组织成纤维细胞超微结构接近，同时采用HE染色、免疫组织化学染色检测形态学及表型变化，结果也具有一致性。因此，选择（第8代）成纤维细胞进行实验，实验分组如下：（1）瘢痕组织成纤维细胞组（阳性对照组）；（2）阴性对照组（正常皮肤成纤维细胞不予LPS刺激）；（5）LPS刺激组（正常皮肤成纤维细胞给予LPS刺激）。采用下列方法检测成纤维细胞增殖和分泌特性：MTT比色法检测成纤维细胞增殖活性；3H-脯氨酸掺入、胃蛋白酶消化法检测成纤维细胞内胶原合成量，同时采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测成纤维细胞培养上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量。采用下列方法检测成纤维细胞基因学指标：逆转录-聚合酶链反应技术（RT-PCR）检测成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原及胶原酶mRNA表达，基因芯片技术检测成纤维细胞基因表达谱的变化，通过与自身增生性瘢痕组织成纤维细胞相关基因进行对比，挑选差异基因，采用RT-PCR法进行验证。除了上述指标以外，我们还采用ELISA法检测成纤维细胞培养上清液中TGF-β1、IFN-γ的含量，探讨LPS对成纤维细胞的可能作用机制。结果：1．LPS对成纤维细胞增殖活性和胶原合成的影响LPS刺激浓度在0.005μg／ml～0.5μg/ml时，促进成纤维细胞增殖和胶原合成（P＜0.05），以0.1μg／mlLPS刺激作用最为明显，LPS刺激浓度为1.0μg／ml时，则抑制成纤维细胞增殖和胶原合成（P＜0.05）。2．0.1μg/ml LPS刺激并传代后不同代次成纤维细胞的病理学变化自第8代开始成纤维细胞超微结构与自身增生性瘢痕组织成纤维细胞超微结构近似，同时采用HE染色、免疫组织化学染色检测形态学及表型变化，结果也具有一致性。3．0.1μg/ml LPS刺激并传代后成纤维细胞增殖活性的变化0.1μg／mlLPS刺激并传代后成纤维细胞增殖率增加，且其增殖率与自身增生性瘢痕组织成纤维细胞增殖率近似，统计学分析无显著差异（P＞0.05）。4．0.1μg/ml LPS刺激并传代后成纤维细胞胶原合成及Ⅰ、Ⅲ型胶原分泌的变化0.1μg／ml LPS刺激并传代后成纤维细胞胶原合成及各时间点Ⅰ、Ⅲ型胶原的分泌增加、Ⅰ／Ⅲ型胶原比例提高，且与自身增生性瘢痕组织成纤维细胞胶原合成及Ⅰ、Ⅲ型胶原的分泌量、Ⅰ／Ⅲ型胶原比例近似，统计学分析无显著差异（P＞0.05）。5．0.1μg／ml LPS刺激并传代后成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原及胶原酶mRNA表达的变化0.1μg／ml LPS刺激并传代后成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA的表达升高、胶原酶mRNA表达下降，且Ⅰ、Ⅲ型前胶原及胶原酶mRNA表达量与自身增生性瘢痕组织成纤维细胞表达量近似（P＞0.05）。6．0.1μg／ml LPS刺激并传代后成纤维细胞基因表达谱的改变0.1μg/ml LPS刺激并传代后成纤维细胞基因表达谱发生改变，其中与胶原代谢相关的一些基因（Ⅰ型胶原、c-myc、TGF-β1）表达均上调，经RT-PCR验证，这些基因表达与自身增生性瘢痕组织成纤维细胞表达量近似（P＞0.05）。7．0.1μg/ml LPS刺激并传代后成纤维细胞培养上清液中TGF-β1、IFN-γ含量的变化0.1μg/mlLPS刺激并传代后各时间点成纤维细胞TGF-β1的分泌增加、IFN-γ的分泌减少，与自身瘢痕组织成纤维细胞分泌量近似，相比无统计学差异（P＞0.05）。结论：1、一定浓度的LPS刺激后可使成纤维细胞的生物学特性发生改变：细胞增殖和胶原合成增加，过高浓度则呈抑制作用，提示适度的LPS存在可能不影响甚至有利于创面愈合，LPS过多则可能延缓创面愈合时间。2、特定浓度的LPS刺激并传代后，成纤维细胞具备自身增生性瘢痕组织成纤维细胞的形态学特征及某些生物学特性：超微结构、形态学、表型一致，细胞增殖加快和胶原合成增加，Ⅰ、Ⅲ型胶原分泌增加，Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达上调，胶原酶mRNA表达下调，同时基因表达谱也进一步证实了基因学变化。提示LPS可能诱导正常皮肤成纤维细胞转化为增生性瘢痕组织成纤维细胞，参与增生性瘢痕形成。LPS的作用机制可能与其促进TGF-β1的分泌，而抑制IFN-γ的分泌有关。