水稻U-box/ARM蛋白家族的鉴定、表达分析及其互作因子的筛选

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水稻,属于禾本科、稻属,其作为重要的粮食作物之一为世界约一半人口提供主要食物来源。在科学研究中,水稻作为一种单子叶模式植物,具有较小的基因组并且已经被测序和注释完毕,其为研究作物产量、筛选杂种优势、抗虫抗旱等其他逆境胁迫研究方向提供重要遗传材料和农业作物。U-box/ARM蛋白作为只在拟南芥、水稻等高等植物中发现的一类蛋白,在动物及藻类等低等植物中尚未发现。该蛋白的特征是含有两个保守结构域:U-box和ARM(Armadillo repeats domain)结构域。其中,ARM结构域是由多个含有约42个氨基酸的基序(ARM repeats)经过串联重复形成的超螺旋结构,具有结合功能。U-box结构域是一种类似于修饰性环指(RingFigure)功能域,具有泛素连接酶(E3)活性,参与泛素、26S蛋白酶复合体的降解过程。已有研究发现,U-box/ARM蛋白作为高等植物中所特有的一类蛋白,在植物自交不亲和反应、抗病性、激素调控以及花期控制等重要生理过程发挥作用。  对水稻中存在的U-box/ARM蛋白研究报道目前还尚少,本课题选取水稻U-box/ARM蛋白家族为研究对象,对水稻中27个U-box/ARM蛋白进行系统进化分析、时空表达分析。同时利用酵母双杂交体系,筛选与U-box/ARM蛋白存在互作关系的关键蛋白。本课题主要实验结果如下所示:  (1)对水稻U-box/ARM蛋白进行系统进化分析,根据进化树分成三大类。结合结构域特征,可以得出该蛋白在水稻中的多拷贝现象离不开ARM结构域在蛋白结构中的排列和repeat数目两方面的进化过程。除去U-box和ARM结构之外,还有个别蛋白含有其他主要结构域,例如卷曲螺旋结构区域和跨膜区域。结合拟南芥中的U-box/ARM蛋白,比较其与水稻U-box/ARM蛋白系统进化关系,发现两种植物的U-box/ARM蛋白同源性较高。这也说明两种主要结构域在进化过程中具有保守性。  (2)对U-box/ARM基因家族进行荧光定量分析,选取水稻组织不同时期不同组织的材料为模版。时空表达数据可以看出U-box/ARM基因在不同组织间的表达水平存在一定差异性。根据聚类图分成两大类,第一聚类里的基因在各组织中表达量都相对较低,而第二大聚类里的U-box/ARM基因在多数组织中都有表达,但是各有差异。  (3)针对水稻U-box/ARM和EXO70这两大多拷贝家族,选取在水稻生殖组织中尤其柱头中表达量相对较高的基因进行互作验证。通过酵母双杂交体系并没有得出互作蛋白。推测对于自花授粉的水稻而言,挑选的这些U-box/ARM蛋白与EXO70蛋白没有相应的信号传递,使它们之间发生互作。  (4)选取U-box/ARM蛋白家族中的OsPUB23(LOC_Os12g17900)蛋白构建诱饵质粒,以其为诱饵蛋白对水稻混合型柱头文库进行筛库工作,经过重复划线,点对点验证,共筛得两个互作蛋白:LOC_Os01 g73620和ZOS1-18蛋白。其中,对水稻LOC_Os01g73620的研究还尚未有,但是其同源蛋白BD2g39470和ZM08g21690都被预测为干旱诱导蛋白。而ZOS1-18蛋白是C2H2类型的锌指蛋白,推测其作为转录因子,参与核酸转录过程。因为其与拟南芥STOP1基因同源性较高,推测OsPUB23蛋白参与调控水稻抗逆境过程。
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