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目的：
本实验通过观察中药芪归解毒汤含药血清对硫酸镍致晶状体上皮细胞损伤的保护作用,以探讨接触过量镍与白内障发病的相关性及中药干预治疗的作用机制。
方法：
1.细胞常规培养：细胞用含20％的胎牛血清与100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM培养基中培养,放于37℃、5％CO2的培养箱中,取对数生长的细胞用于实验。
2.细胞中加入不同浓度的硫酸镍(100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml),四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测不同浓度的硫酸镍对人眼晶状体上皮细胞株LEC的增殖抑制作用,乳酸脱氢酶比色法(LDH)测定硫酸镍对晶体上皮细胞株LEC细胞膜的损伤作用,透射电镜观察细胞超微结构改变,流式细胞术检测细胞凋亡。
3.采用中药血清药理学方法提取含芪归解毒汤药物血清和空白血清。
4.四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测芪归解毒汤药物血清对硫酸镍损伤的晶状体上皮细胞株LEC细胞存活力的影响,乳酸脱氢酶比色法(LDH)测定芪归解毒汤药物血清对硫酸镍引起的细胞膜损伤的影响,透射电镜观察中药对硫酸镍损伤后的细胞超微结构改变的影响,流式细胞术检测中药对硫酸镍损伤后的细胞凋亡的影响。
5.半定量逆转录-聚合酶链反应(SqRT-PCR)法测定芪归解毒汤和硫酸镍对人眼晶状体上皮细胞株LEC中HSP27mRNA表达的影响。
结果：
1.不同浓度的硫酸镍作用于晶状体上皮细胞24h、48h后,细胞的生长受到明显抑制,并且随着浓度及时间的增加,抑制率也逐渐增加。24小时的半数抑制浓度(IC50)为162.71μg/ml,48h后的半数抑制浓度(IC50)为129.31μg/ml。
2.五种不同浓度的硫酸镍作用于晶状体上皮细胞株LEC 24小时后,培养液中LDH值增加,与空白对照组LDH值相比,差异有显著性,提示随着浓度的增加,硫酸镍对细胞膜的损伤也逐渐加重。
3.162.71μg/ml浓度的硫酸镍作用晶状体上皮细胞株LEC 24小时后,透射电镜下观察到有凋亡小体出现,细胞呈凋亡形态学改变；流式细胞术检测发现,细胞出现明显的凋亡峰,并测得凋亡率达26.80％,与空白对照组凋亡率0.18％相比,差异有显著性(P<0.05),说明硫酸镍能够诱导晶状体上皮细胞株LEC发生凋亡。
4.加入芪归解毒汤药物血清后,与硫酸镍组相比,细胞存活力增加,细胞膜损伤程度减轻,细胞呈凋亡早期改变,凋亡率降低,并能使细胞中HSP27mRNA表达增加。说明芪归解毒汤能够减轻硫酸镍引起的细胞凋亡,对细胞具有保护作用。
结论：
1、硫酸镍能够诱导人晶状体上皮细胞株LEC凋亡。
2、芪归解毒汤含药血清能够抑制硫酸镍诱导的细胞凋亡,从而发挥保护作用。
3、芪归解毒汤发挥保护作用的机制可能与使细胞中HSP27mRNA表达增加有关。