论文部分内容阅读
偏头痛是一种严重威胁生存质量的脑功能障碍性疾病，其人群发病率、患病率和复发率均高。偏头痛发作时的特征主要包括单侧(偏侧)搏动性头痛、中-重度头痛、持续时间(未经治疗或治疗无效)达4-72小时、日常活动或工作能加重头痛程度以及可能出现先兆症状，伴随症状可有恶心、呕吐等。偏头痛对人类社会的巨大危害已引起欧洲神经病协会联盟(European Federation ofNeurological Societies，EFNS)和世界卫生组织(WHO)等的高度重视。目前，偏头痛的发病机制尚未完全阐明。神经源性炎症机制(neurogenic inflammation)是当前研究最广、也最受学者关注和重视的偏头痛发病机制之一。
经源性炎症机制认为，各种致病因素引起的三叉神经血管系统(trigeminovascular system)上的无菌性炎症反应是激活三叉神经血管系统进而启动偏头痛发作的重要原因。目前大量研究表明，降钙素基因相关肽(calcitoningene-related peptide，CGRP)及核因子-κB(NF-κB)在神经源性炎症机制中均发挥着重要作用。具体地，在一定刺激下，三叉神经血管系统可释放CGRP，同时三叉神经血管系统中的核因子-κB(NF-κB)被激活，释放的CGRP和激活的NF-κB随即导致一系列无菌性炎症反应，激活三叉神经血管系统，最终启动头痛的发生。
三叉神经脊束尾核(trigeminal nucleus caudalis，TNC)上CGRP的释放和NF-κB的激活是目前偏头痛神经源性炎症机制研究的重点和热点之一。另外，大量研究结果提示，硝酸甘油(NTG)及其体内产物NO在偏头痛发病机制中具有重要作用。特别地，神经源性炎症机制是NTG参与偏头痛发病机制的重要内容，如大量研究提示，NTG可以导致TNC上CGRP的释放和NF-κB的激活。因此，NTG诱导的偏头痛模型适于开展神经源性炎症机制方面的研究。
阿托伐他汀(atorvastatin，AT)是最常用且有效的他汀类调脂药，最近越来越多的研究表明，阿托伐他汀尚可能对多种神经系统疾病模型发挥积极作用。近来还有报道认为阿托伐他汀可能具有潜在的防治偏头痛的作用，并推测这种作用可能与其多靶点的的生理效应特别是抗炎症反应作用密切相关。另外，有研究还发现，在非偏头痛状态下或在非偏头痛模型中阿托伐他汀对CGRP的释放及NF-κB的激活具有抑制作用。
目的：在建立硝酸甘油诱导的大鼠偏头痛模型的基础上，探讨阿托伐他汀预处理后能否对NTG导致的TNC上CGRP的释放及NF-κB的激活产生抑制作用，从而起到拮抗CGRP及NF-κB在神经源性炎症机制中的作用、为阿托伐他汀在抑制偏头痛神经源性炎症机制方面提供重要的证据。
方法：
⑴所有动物均按实验需要分入5组内(CONT组、AT组、NTG组、AT(1mg/kg)+NTG组及AT(10mg/kg)+NTG组)。在第一部分中，每组免疫组化及ELISA各7只，即每组14只；在第二部分中，每组免疫荧光双标染色及Westem Blot各7只，共14只。
⑵在使用NTG建立偏头痛大鼠模型前连续5天(d)内，将AT以低剂量(1mg/kg)和高剂量(10mg/kg)分别灌胃SD大鼠，一次/d。
⑶AT连续灌胃5天后，腹腔注射(i.p.)NTG(10mg/kg)。模型成功的标志——NTG注射后2h内大鼠挠头次数明显增加，并有统计学意义。
⑷NTG注射后2h内观察并计数单位时间内大鼠的挠头次数。
⑸NTG注射后立即(0h)、1h、2h及4h共4个时间点处死动物，取大鼠高颈髓(C1-C2)作冰冻组织切片，观察高颈髓(C1-C2)背角浅层Ⅰ、Ⅱ板层内CGRP免疫染色情况。
⑹NTG注射后ELISA检测各个时间点大鼠颈静脉血内CGRP水平。
⑺NTG注射后应用荧光免疫双标技术观察各个时间点NF-κB在高颈髓(C1-C2)背角浅层神经元的免疫染色情况。
⑻NTG注射后应用Western Blot定量分析各个时间点NF-κB核蛋白在高颈髓(C1-C2)背角浅层的表达。
⑼所有统计学数据采用SPSS16.0进行单因素方差分析(ANOVA)，以p＜0.05为差异有统计学意义。
结果：
①NTG注射后30min内，大鼠即开始出现明显烦躁、双耳明显发红、爬笼明显及挠头明显增加等现象，上述现象可持续至1.5h左右，此后大鼠转为倦怠、活动明显减少。CONT及AT组并无上述行为学的改变，NTG注射后30-60min内，挠头等现象最为突出，60-90min后挠头等现象逐渐呈减少趋势，但与对照组比较仍有显著性差异。但是，经AT预处理后，在不同时间段内，NTG注射后引起的挠头等现象都有显著的抑制。
②NTG i.p.注射后的1h、2h及4h各时间点，大鼠TNC内CGRP阳性神经膨体的密度均明显下降，表现为：神经膨体结构明显疏松变稀、着色明显变淡变浅，与CONT及AT组相比，CGRP免疫阳性强度的降低具有显著性差异。阿托伐他汀预处理后，NTG i.p.注射所致的CGRP免疫阳性强度的降低可以被不同程度地逆转。
③NTGi.p.注射后的1h、2h及4h各时间点，大鼠颈静脉血中的CGRP水平均显著升高(与CONT及AT组对照组相比)，阿托伐他汀预处理后，NTG i.p.注射所致的颈静脉血CGRP水平的升高可以被不同程度地逆转。
④在各时间点，CONT及AT组均可以在大鼠高颈髓(C1-C2)背角TNC内观察到一些NF-κB阳性神经元，但数量较少。NTG i.p.注射后在相同的时间点(1h、2h及4h，不包括0h)所观察到的NF-κB阳性神经元明显增多。阿托伐他汀预处理后，NTG i.p.注射所致的NF-κB阳性神经元数的增加可以被不同程度地抑制。
⑤NTG i.p.注射后的1h、2h及4h各时间点，N-NF-κB的水平明显升高。阿托伐他汀预处理后，NTG i.p.注射所致的N-NF-κB水平的升高可以被不同程度地抑制。
结论：⑴硝酸甘油(NTG)参与大鼠偏头痛神经源性炎症机制与其促进三叉神经脊束尾核(TNC)CGRP的释放和NF-κB的激活密切相关。⑵阿托伐他汀抑制大鼠偏头痛神经源性炎症机制可能与其抑制TNC上CGRP的释放密切相关。⑶阿托伐他汀抑制大鼠偏头痛神经源性炎症机制可能与其抑制TNC上NF-κB的激活密切相关。