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目的:天疱疮是一类由自身抗体介导的慢性、器官特异性、自身免疫性大疱性皮肤病,以患者体内出现针对表皮角质形成细胞表面天疱疮抗原的特异性IgG引起棘层松解为特征.天疱疮发病中同时存在细胞免疫和体液免疫紊乱.天疱疮抗原刺激B细胞产生自身抗体是导致天疱疮发病的主要因素,而B细胞产生自身抗体是T细胞依赖性的.该实验选取含有能被寻常型天疱疮患者血浆中的"致病性抗体"特异性识别,含有"免疫优势表位"或称"致病性表位"的天疱疮抗原胞外结构域Dsg3EC<,1-2>基因片段,经原核表达获得重组嵌合毒素Dsg3EC<,1-2>PE40,并分离寻常型天疱疮患者的外周血PBMC,分别观察重组嵌合毒素对寻常型天疱疮患者外周血T、B淋巴细胞的影响,为进一步探讨寻常型天疱疮的靶向生物学治疗奠定基础.方法:在BL21trxB(DE3)中对重组嵌合毒素Dsg3EC<,1-2>PE40进行诱导表达,经免疫蛋白印迹试验对重组嵌合毒素进行鉴定并用IMAC方法进行纯化.在此基础上,分离寻常型天疱疮患者PBMC,并进一步分离出T淋巴细胞,分别以不同浓度的重组嵌合毒素作用于天疱疮患者的T、B淋巴细胞,通过ELISPOT方法从单个细胞水平检测抗体分泌B细胞的变化,并通过MTT比色试验及<3>H-TdR掺入试验来观察重组嵌合毒素对T细胞的代谢及增殖的影响.结果:1. Dsg3EC<,1-2>PE40在BL21trxB(DE3)中以可溶性形式表达,而Dsg3EC<,1-2>在AD494(DE3)中则以包涵体形式表达;从各时相的表达情况看到,Dsg3EC<,1-2>的表达量随时间延长而增加,而Dsg3EC<,1-2>PE40表达量随时间延长而增加的趋势不明显.2. Western Blotting结果显示重组嵌合毒素蛋白能够特异性与Pab IgG结合,而与正常人IgG不能发生结合.3. 纯化后的重组嵌合毒素经浓缩后,终浓度达547μg/ml,用Quantity One软件分析其纯度达80﹪以上.4. ELISPOT结果显示,与Dsg3EC<,1-2>相比,重组嵌合毒素可使PV患者外周血PBMC中的抗体分泌B细胞数量减少约40﹪左右;5. MTT试验及<3>H-TdR掺入试验结果可见在Dsg3EC1-2PE40作用下,T细胞的代谢、增殖较重组Dsg3EC<,1-2>明显降低,二者间具有显著性差异,且当重组嵌合毒素的浓度达到约25μg/ml时,其作用趋于稳定.结论:1. 对含有天疱疮抗原Dsg3抗原优势表位的Dsg3EC<,1-2>片段及其重组嵌合毒素Dsg3EC<,1-2>PE40成功进行了原核表达、纯化和鉴定,所得重组嵌合毒素能够满足实验的需要,为深入研究其生物学功能奠定了基础.2. 重组嵌合毒素能够特异性与PabIgG结合,而与正常人IgG不发生结合.3. 重组嵌合毒素分子可以降低PV患者外周血抗体产生B细胞的抗体产生作用.同重组Dsg3EC<,1-2>相比,抗体产生B细胞数量减少达40﹪左右.4. 重组嵌合毒素对PV患者的外周血T细胞具有抑制或杀伤作用,与Dsg3EC<,1-2>比较,Dsg3EC<,1-2>PE40可使其增殖代谢活性明显降低.