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洋地黄类药物(Digitalis)是一种细胞内Na+/K+-ATPase的特异性配体,临床上广泛用于心力衰竭的治疗。近年来的研究表明该类药物对恶性肿瘤细胞具有明显的抑制作用。我们的前期工作发现,洋地黄类药物地高辛和哇巴因能够诱导人非小细胞肺癌细胞发生自噬性死亡,但该类药物是否能诱导其他肿瘤细胞发生自噬及相关激酶信号通路,至今尚不清楚。本研究拟选用人非小细胞肺癌细胞A549和人乳腺癌细胞MCF-7作为研究对象,进一步探讨洋地黄类药物诱导肿瘤细胞发生自噬的条件及相关AMPK、Src及ERK1/2等激酶在其中的调控作用。采用MTT法及克隆形成实验检测哇巴因对肿瘤细胞的生长抑制情况,发现哇巴因在纳摩尔水平对肿瘤细胞具有很强的生长抑制作用,但对正常细胞影响不大。经吖啶橙染色后,荧光显微镜观察到细胞内亮红色荧光的增强,流式细胞术定量检测到FL3/FL1荧光比值呈时间依赖性显著升高,Western Blot检测到药物处理后LC3-Ⅱ的蓄积及p62的下降,并在溶酶体酸化抑制剂作用下能进一步增强LC3-Ⅱ表达,免疫荧光检测到LC3由弥散分布趋向于点状凝集,上述结果证明IC50浓度范围内的哇巴因(25nM)能够诱导人肿瘤细胞A549及MCF-7发生自噬性死亡但对正常细胞MRC5无明显作用。流式细胞术检测到哇巴因能引起细胞内活性氧自由基(ROS)水平呈剂量及时间依赖性升高,使用Src抑制剂PP2能有效拮抗这一过程,抗氧化剂NAC则能显著下调LC3-Ⅱ表达,提示Src参与调节药物引起的ROS生成,而ROS介导自噬的发生Western Blot检测到哇巴因能引起AMPK、Src、ERK1/2、PERK及eIF2a磷酸化水平的上调,并且检测到体外AMPK活性的升高和细胞内ATP含量的降低,提示洋地黄类药物同时激活ATP/AMPK及Src/ERK1/2双重信号通路。采用抑制剂PP2或siRNA-Src分别抑制Src活性或敲低Src蛋白后发现,药物引起的ERK1/2活化被显著拮抗,LC3-Ⅱ表达随之降低,并进一步发现吖啶橙阳性反应的消失及细胞毒作用的减弱,提示Src在药物诱导的自噬过程中起正调控作用。免疫共沉淀实验检测到AMPK与Src之间存在蛋白相互作用,AMPK处于上游并调节Src活性。综上所示,洋地黄类药物对肿瘤细胞有显著的选择性杀伤作用,在IC50浓度范围内,该类药物通过激活ATP/AMPK及Src/ERK1/2双重信号通路,同时诱导细胞内质网应激和ROS水平的升高而导致肿瘤细胞发生自噬,其中AMPK与Src之间存在交叉调节,AMPK在上游调节Src活性。