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研究目的:本研究分析了小鼠未成熟DC(iDC)分泌的exosomes(iDex)的生物学特性,并比较了经IL-10和TGF-β1诱导的调节性DC(rDC)分泌的exosomes(rDex)与iDex诱导T细胞免疫耐受的作用,此外还进一步探讨了rDex对急性移植物抗宿主病(aGVHD)的影响。
材料与方法:(1)取C57BL/6小鼠骨髓细胞诱导未成熟DC(iDC),使其负载自身抗原,LPS促成熟后(mDC)流式细胞术检测两种DC表型。(2)采用超速离心结合膜超滤的方法提取iDC上清中的exosomes,测定iDex的粒径,电镜观察iDex的形态,Western blot测定iDex所含的蛋白分子。(3)用TGF-β1联合IL-10从C57BL/6小鼠骨髓细胞诱导调节性DC(rDC),采用流式细胞术观察其表型,并提取其分泌的rDex。(4)建立小鼠皮肤移植模型,供鼠为C57BL/6小鼠,受鼠为BALB/c小鼠,受鼠移植前经尾静脉注射供鼠的iDex和rDex,分为PBS组、iDex组和rDex组,观察移植皮片存活情况。(5)观察皮肤移植的受者BALB/c小鼠对供者C57BL/6小鼠及第三方供者DBA/2小鼠的单向混合淋巴细胞反应(MLR)。(6)建立aGVHD模型,供鼠为C57BL/6小鼠,受鼠为DBA/2小鼠,在给受鼠注射供鼠骨髓细胞(BMC)和脾细胞(SC)的同时注射供鼠来源的rDex,观察aGVHD症状及生存期的变化。(7)WesternBlot方法检测iDex与rDex表达的相关分子,探讨诱导耐受的可能机制。
结果:小鼠骨髓细胞来源的iDCs和mDCs均高表达髓系标记CD11c,LPS促成熟后MHCⅡ和共刺激分子CD80、CD86、CD40表达明显升高。超速离心结合膜超滤方法提取的iDex99.97％平均直径在100nm以下,平均粒径为78.9±26.8nm；在电镜下可以清楚地观察到iDex为中间略凹的扁平碟状小囊泡；Western Blot显示iDex表达DC功能相关的分子I-A/I-E、CD80、CD86和CD54。流式分析rDC表型表明TGF-β1、IL-10可下调DC表面共刺激分子CD80、CD86、CD40的表达。移植皮片存活时间iDex组为(10.7±0.7)d,明显长于PBS组(7.5±0.5)d(P<0.05)；rDex组为(18.8±1.1)d,明显长于iDex组和PBS组。MLR结果证明iDex组和rDex组BALB/c小鼠均对C57BL/6小鼠的脾细胞产生特异性耐受,尤其是rDex组,对第三方供者DBA小鼠的脾细胞两组仍表现出强烈的免疫应答。通过尾静脉输注供鼠BMC和SC成功建立了aGVHD模型,在此模型应用rDex减轻了aGVHD的症状并延长了受鼠的生存期。
结论:小鼠iDex可延长同种异基因皮肤移植皮片的存活时间,有诱导免疫耐受的作用；rDex除明显延长移植皮片存活时间外还延长了aGVHD小鼠的生存期,较iDex诱导免疫耐受的作用更强,提示TGF-β1和IL-10诱导的调节性DC分泌的rDex在免疫耐受中发挥重要作用,有望应用于同种异基因的免疫排斥及aGVHD。