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糖尿病肾病是糖尿病的严重并发症之一,约30%一40%1型糖尿病患者和15%的2型糖尿病患者会发展到终末期肾病。糖尿病中已有肾小管功能异常的报道,提示肾小管在糖尿病肾病发展过程中具有关键作用。然而在糖尿病时,肾小管功能异常的确切机制还不清楚。自噬是一个自我降解的过程,对于在关键时刻平衡能量来源十分重要。自噬还在清除错误折叠和聚合的蛋白质、受破坏的细胞器例如线粒体、内质网、过氧化物酶体以及细胞内的病原体等方面具有重要作用。因此,自噬被视为一种生存机制。对自噬的错误调节可以导致各种人类疾病的发生。虽然我们对调控自噬的通路还了解的很少,但是越来越多的研究表明了自噬在人类多种生理过程和疾病中的重要性。自噬对于保持β细胞的结构和功能就非常重要,另一方面它的改变也参与了β细胞的死亡,所以自噬对于糖尿病到底是起保护作用还是有害,并不是很清楚。关于自噬参与糖尿病肾病发病机理的证据就更加缺乏。利拉鲁肽是一种修饰后的GLP-1类似物。GLP-1通过GLP-1受体起作用。它可以刺激葡萄糖依赖的胰岛素分泌、加强β细胞对葡萄糖的应答、刺激β细胞的新生和增殖并且抑制其凋亡,还可以减少胰高血糖素的分泌。就细胞的新生、增殖和凋亡而言,自噬也是一种细胞维持自身稳态的重要机制,由目前研究结果显示,GLP-1对胰岛β细胞等多种细胞的新生、增殖和凋亡具有调节作用,但其对细胞的自噬是否具有调节作用尚不清楚。为了探讨高糖对肾小管细胞的损伤作用,高糖是否能诱导肾小管上皮细胞和糖尿病大鼠肾脏组织自噬的激活,以及利拉鲁肽对其的调节作用,本研究进行了如下实验:实验一、高糖诱导肾小管上皮细胞损伤目的:明确高糖毒性对人近端肾小管上皮细胞的损伤。方法:应用不同浓度的葡萄糖处理肾小管上皮细胞,设定不同时间点,构建高糖诱导肾小管细胞损伤模型,并且同时加入利拉鲁肽共孵育,分别应用MTS/PES比色实验,台盼蓝染色实验和透射电镜,观察细胞的损伤情况以及利拉鲁肽对其的作用。结果:MTS/PES比色实验结果显示,高糖会降低肾小管上皮细胞的活力,且与葡萄糖成浓度依赖性。高糖孵育细胞的时间越长,其活力也下降的更多,呈时间依赖性。台盼蓝实验结果显示,用40mmol/l的葡萄糖孵育细胞24-72h后,与对照组相比,死细胞的比例明显上升,呈时间依赖性。加入利拉鲁肽共孵育后,细胞活力明显提高。透射电镜观察40mmol/l葡萄糖对细胞的状态和超微结构都有明显影响,细胞形态不完整,胞内大量糖原堆积,出现空泡状改变。结论:高浓度的葡萄糖可以降低肾小管上皮细胞的活力、加速细胞死亡,造成细胞形态异常和超微结构的改变。利拉鲁肽可以保护细胞抵抗高糖诱导的细胞损伤。实验二、高糖诱导HK-2细胞自噬激活以及利拉鲁肽对其调节作用目的:探讨高糖是否诱导HK-2自噬的激活、对HK-2细胞中GLP1受体的影响及利拉鲁肽对其的调节作用。方法:应用透射电镜观察40mmol/l高糖处理HK-2细胞72h后自噬体的出现,明确自噬的激活。再应用Western blot法明确GLP1受体在HK-2细胞中的表达。HK-2细胞经高糖处理72h以及加入利拉鲁肽共孵育后,应用实时定量PCR、western blot、免疫荧光染色观察GLP1受体的表达变化以及利拉鲁肽对其表达的影响。应用吖啶橙染色观察自噬标志性的酸性小泡细胞器的表达。再分别应用Western blot检测自噬重要标志物LC3和beclin1的表达情况以及利拉鲁肽对其表达的影响。结果:透射电镜下观察到细胞内出现典型双层膜结构的内包裹细胞器和蛋白的自噬体。HK-2细胞中有GLP1受体的表达。细胞经高糖处理后,GLP1受体的表达明显降低,利拉鲁肽能增加其表达。吖啶橙染色看到高糖处理组出现明显的酸性小泡细胞器堆积。与对照组相比,LC3和beclin1的表达均升高,利拉鲁肽可以降低其表达。结论:高糖可激活HK-2细胞的自噬,利拉鲁肽可能通过上调GLP1受体表达保护细胞,降低其自噬活性。加入GLP-1受体拮抗剂的也验证了是由利拉鲁肽发挥作用。实验三、1型糖尿病大鼠肾脏组织自噬的激活以及利拉鲁肽对其调节作用目的:探讨糖尿病动物模型中,肾脏形态和功能的改变以及糖毒性是否诱导肾脏组织中自噬的激活、对糖尿病大鼠肾脏中GLP1受体的影响及利拉鲁肽对其的调节作用。方法:首先选取正常SD大鼠,随机抽取出正常对照组,其余应用STZ65mg/Kg一次性腹腔注射构建1型糖尿病动物模型,确定造模成功后,将所有大鼠分为正常对照组、DM组、DM加利拉鲁肽注射组(利拉鲁肽0.3μg/Kg/12h皮下注射)和DM加利拉鲁肽及GLP-1受体拮抗剂注射组(利拉鲁肽0.3μg/Kg/12h+exendin-(9-39)25nmol/Kg/12h皮下注射),各组处理4周后处死。测量大鼠体重、血糖、相对肾脏重量、进食量,全自动生化仪测定血清肌酐和尿素氮。应用HE染色法观察大鼠肾脏结构和形态变化。应用western blot法明确GLP-1受体在大鼠肾脏组织中的表达。Western blot法和免疫组化染色检测GLP1受体在各组大鼠肾脏中的表达变化。再应用Western blot、免疫组化染色检测自噬重要标志物LC3和beclin1的表达情况以及利拉鲁肽对其表达的影响。结果:代谢指标方面,DM大鼠的体重较正常组明显减轻,空腹血糖、相对肾脏重量、血清肌酐和尿素氮都远高于正常对照组,并且注射利拉鲁肽治疗后,指标没有明显改善。DM大鼠进食量明显增加,利拉鲁肽注射治疗后,进食量下降。HE染色观察到DM大鼠肾小球明显增生肥大,囊腔减小,肾小管上皮细胞肥大,胞浆内可见空泡变性和基膜增厚;肾小管管腔变窄,肾间质部分出现水肿。Western blot明确大鼠肾脏中有GLP1受体的表达,Western blot和免疫组化结果都显示,与正常组相比,DM大鼠肾脏GLP1受体的表达减少,利拉鲁肽可以增加其表达。应用Western blot和免疫组化检测到LC3和beclin1在DM大鼠肾脏中的表达增加,利拉鲁肽可以减少其表达。结论:糖尿病大鼠肾脏的形态和功能、肾小球和肾小管的结构均受损,肾脏组织自噬激活,利拉鲁肽可能通过上调GLP1受体表达保护肾脏,降低其自噬活性;其作用的机制有待深入研究。注射GLP-1受体拮抗剂组的结果的也验证了利拉鲁肽的调节作用。