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1982年,Warren和Marshall首先从人的胃粘膜中分离出了幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp),并提出了Hp涉及胃炎和消化性溃疡的病因学。之后,人们通过大量的人体试验、抗生素治疗和流行病学等研究,证明了Hp与胃炎、消化性溃疡、胃腺癌以及粘膜相关淋巴样组织淋巴瘤等疾病密切相关。其中,Hp的感染是消化性溃疡的一个主要风险因素,临床上使用抗生素根除Hp,是消化性溃疡患者预防复发的主要措施。尽管如此,Hp感染本身并不是消化性溃疡的必要条件。许多感染Hp的患者并没有发生溃疡,同样,一些胃溃疡患者胃内也未能检测出Hp。研究发现,除了Hp感染,应激、饮食、吸烟以及非甾体抗炎药的使用等,都与消化性溃疡的发病相关。其中,心理应激在一些溃疡病例中起到了决定性作用,并且在溃疡的治疗中起着关键作用。统计数据显示,在30-65%的溃疡病例中,心理应激因素都发挥了作用。1995年日本神户大地震后,胃溃疡病例,尤其是溃疡引起的胃出血病例显著增多,这一点证实了心理应激在消化性溃疡中的显著作用。Hp感染和心理应激都被证实在消化性溃疡中起着重要作用,那么这两者在疾病发生中又有怎样的联系呢?一些研究发现在胃溃疡的形成过程中,Hp感染和心理应激两者存在协同关系。通过动物实验和临床数据表明,Hp感染能影响应激性胃粘膜损伤的进一步发展。然而,心理应激能否加强Hp在胃粘膜上的感染呢?Hp感染和心理应激之间协同致病的内在机制是什么呢?这些问题还有待进一步研究。众所周之,Hp在胃粘膜的感染是一个复杂的过程,受多种因素影响,诸如胃内的微环境、宿主的免疫状态以及细菌的自身状态等等。大量的实验研究发现,心理应激能改变胃粘膜的炎症和免疫反应。粘膜免疫系统可以由中枢神经系统通过下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴和糖皮质激素(GC)产物调节。同时,心理应激也可以影响HPA轴,上调GC的代谢产物。因此,我们推断心理应激可以通过神经内分泌系统影响粘膜免疫系统,进而可以影响Hp在胃粘膜的感染。此外,心理应激也可以影响Th1/Th2平衡,表现为机体细胞免疫功能受到抑制,也是影响Hp感染的原因之一。本实验以心理应激模型和Hp感染模型为基础,研究心理应激对Hp感染影响的协同作用,初步探讨心理应激影响BALB/c小鼠胃内Hp感染的机制。研究目的1.采用旁观电击试验建立BALB/c小鼠心理应激模型,观察BALB/c小鼠行为学、内分泌学指标的改变,以评价本研究建立的BALB/c小鼠心理应激模型的有效性。2.在建立心理应激模型的基础上, BALB/c小鼠再口服感染幽门螺杆菌,研究心理应激与Hp感染的关系,并初步探讨其协同作用机制。研究方法1. BALB/c小鼠心理应激模型的建立:旁观电击试验:在此模型中,将大鼠分为心理应激组和足部电击组,实验场所为一分成A、B两种区域的箱子,两区之间通过透明的带孔树脂板隔开,足部电击组的大鼠放在A区的格间中,心理应激组的大鼠放在B区的格间中。通过电击发生器对A区的大鼠进行无规律的间歇性足底电击刺激。B区的大鼠没有遭受电击,但能通过视觉、听觉、以及嗅觉系统接收来自电击小鼠组的信息,引起心理应激。心理应激组BALB/c小鼠每天上午9:00～12:00间进行应激试验,每次30分钟,持续14天。对照组BALB/c小鼠在相同的时间段放入小室相同时间,但不进行应激。足部电击BALB/c小鼠仅用于产生刺激,不进行其他实验处理。在1周和2周心理应激结束后,分别通过旷场试验,观察正常组和心理应激组BALB/c小鼠行为学改变,并且检测BALB/c小鼠血清皮质酮水平的改变。以BALB/c小鼠的行为学和内分泌学指标评价本研究建立的心理应激模型。2.心理应激对BALB/c小鼠免疫功能的影响:将20只BALB/c小鼠随机分为对照组(C)和心理应激组(PS),每组10只。对PS组小鼠进行心理应激,分别收集PS组和C组BALB/c小鼠外周血,用ELISA方法检测血清IL-2、IL-4水平。3.心理应激对BALB/c小鼠胃内Hp感染的影响:将72只BALB/c小鼠随机分为正常组(C)、心理应激组(PS)、Hp感染组(HI)、心理应激+药物组(RP)、心理应激+Hp感染组(PH)和心理应激+Hp感染+药物组(RPH),每组12只。分别对各组小鼠施以心理应激和(或)Hp口服感染及药物处理,5周后处死所有小鼠收集标本。运用realtime PCR方法检测BALB/c小鼠胃组织Hp的定植量,并通过对胃粘膜组织做石蜡切片,HE染色病理学评分,检查胃黏膜损伤程度。研究结果(一)心理应激模型的建立及评价1.动物行为表现:心理应激组BALB/c小鼠初次放入交流箱内,探索欲望很强,前爪直立,以鼻嗅四壁。接通电流后,受电击BALB/c小鼠惊跳、尖叫,心理应激组BALB/c小鼠受其影响,身体蜷缩,微闭双眼,处于惊恐状态。在心理应激1周和2周后,分别对应激组BALB/c各小鼠进行旷场试验。与对照组相比,心理应激组(1周)的水平得分、垂直得分两个指标都显著下降(P<0.05);同样,心理应激组(2周)的行为学指标与对照组相比也有显著的下降(P<0.05)。2.血清皮质酮的测定:在应激前、应激1周和应激2周后,分别对对照组和心理应激组BALB/c小鼠进行血清皮质酮检测。对照组BALB/c小鼠在应激前后血清皮质酮水平没有显著变化(P>0.05);而心理应激组BALB/c小鼠(PS)和药物处理+心理应激组BALB/c小鼠(RP)在应激1周和2周,血清皮质酮水平显著提高(P<0.05)。3.血清IL-2、IL-4浓度的测定:在应激结束后,将所有BALB/c小鼠处死收集外周血,进行血清IL-2、IL-4检测。心理应激组BALB/c小鼠血清IL-2水平较对照组显著降低(P<0.05),IL-4水平较对照组显著升高(P<0.05).(二)心理应激对Hp感染的影响1. Hp在BALB/c小鼠胃粘膜的定植情况:我们对Hp感染组(HI)、心理应激+Hp感染组(PH)和RU486+心理应激+Hp感染组(RPH)BALB/c小鼠进行口服Hp菌液感染。Hp感染5周后,收集BALB/c小鼠胃组织。经过Hp血平板培养、尿素酶试验和胃组织切片染色镜检等方法鉴定,HI组、PH组和RPH组的Hp感染率达到100%。采用Realtime PCR方法对胃组织进行16srDNA的扩增,通过对BALB/c小鼠胃组织中16srDNA扩增从而定量检测胃组织中Hp的定植量。相对于HI组,PH组BALB/c小鼠胃组织Hp定植量显著增高(P<0.05);在心理应激前用RU486对BALB/c小鼠预处理,使得RPH组BALB/c小鼠胃组织Hp定植量显著低于PH组(P<0.05)。2. Hp和心理应激造成的BALB/c小鼠胃粘膜损伤:对各组BALB/c小鼠胃组织做病理切片镜检,选取各组有代表性切片比较。C组和PS组之间,胃粘膜无明显损伤;RPH组胃粘膜有轻微炎症;HI组胃粘膜出现明显粘膜缺损;在PH组切片中,我们可以看到更广泛的粘膜损伤,并伴随溃疡的出现,同时,粘膜腺体萎缩、粘膜出血、淋巴滤泡形成等情况也出现在PH组切片中。对胃组织病理切片做炎症评分,数据经Kruskal-Wallis分析,显示5个组别的炎症得分存在显著差异(P<0.05);每两组数据两两比较,Mann-Whitney检验显示:PH组胃粘膜炎症程度显著高于其余各组(P<0.05);PS组和C组之间胃粘膜炎症程度无显著性差异(P>0.05);HI组、RPH组BALB/c小鼠的胃粘膜炎症程度显著高于C组(P<0.05)。这些证据表明,心理应激并没有直接造成BALB/c小鼠胃粘膜的组织学改变,但是却加重了Hp感染对胃粘膜造成的损伤。主要结论1.成功建立BALB/c小鼠单纯心理应激模型,并通过行为学和内分泌指标对模型进行评价,符合心理学标准。由于本模型将动物的生理性或躯体性因素降至极低,因此能更好的模拟人的情绪反应。2.心理应激后BALB/c小鼠血清IL-4水平升高和IL-2水平降低,说明单纯心理应激能够影响小鼠Th1/Th2平衡,抑制机体的细胞免疫功能。3.证明了心理应激可以增加BALB/c小鼠胃内Hp的定植量,加重了Hp感染后的胃粘膜损伤。初步探明其机制可能是由于心理应激通过激活HPA轴,释放大量GC,以及心理应激导致机体细胞免疫功能受到抑制引起的。研究意义首次证实了心理应激能通过激活HPA轴,导致机体GC增多和抑制细胞免疫功能,从而增加Hp在BALB/c小鼠胃粘膜的定植,加重Hp感染引起的胃粘膜损伤。本研究将为探明Hp相关性疾病的多因素致病机制提供理论依据,为临床抗Hp感染治疗消化性溃疡病提供新的思路。此外,应激-感染模型的验证成功,将突破传统的“病原单一论”思想,在目前生物医学模式向生物-心理-社会医学模式转变的背景下具有较大实践意义。