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研究目的：糖尿病(Diabetes mellitus, DM)是影响人类健康的全球性公共问题,预计到2030年全球糖尿病患者将增至4.39亿。糖尿病微血管并发症(Microvascular complications)和大血管并发症(Macrovascular complications)是糖尿病患者伤残和死亡的重要原因。高血糖导致的内皮功能障碍(Endothelial dysfunction)使血管舒张功能和收缩功能受损,破坏了血管的完整性。内皮功能障碍被认为是1型和2型糖尿病的早期标志,可用于血管疾病的独立预测。因此,改善血管内皮功能对于糖尿病并发症的预防和治疗具有重要意义。非诺贝特(Fenofibrate, FF)是过氧化物酶体增殖物激活受体α(Peroxisome proliferator-activated receptor α, PPARα)的激动剂,临床用于降血脂。2010年美国心脏病学学会公布的ACCORD (Action to Control Cardiovascular Risk in Diabetes)试验表明,非诺贝特联合辛伐他汀的治疗能降低伴血脂异常的2型糖尿病患者的心血管并发症风险。一氧化氮(Nitric oxide, NO)由内皮型一氧化氮合酶(Endothelial nitric oxide synthase, eNOS)产生,参与调节血管功能,在炎症和血管病变发生发展过程中发挥关键作用。NO的生物利用度取决于其产生和降解失活之间的平衡。糖尿病高血糖导致的高氧化应激(Oxidative stress,OS)状态使eNOS脱耦联,超氧化阴离子(Superoxide onion, O2-)过度产生,导致NO生物利用度降低。另一方面,NO的生物利用度降低,使血小板聚集增强、血管内皮细胞对单核细胞粘附作用增加而导致内皮功能障碍。腺苷单磷酸盐激活蛋白激酶(Adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)是高灵敏度的细胞代谢传感器,可控制下游目标蛋白eNOS的表达。已有实验证实,激活AMPK可通过增加p-eNOS的表达改善血管功能障碍。本课题研究：非诺贝特是否能够改善糖尿病小鼠内皮依赖性舒张功能；非诺贝特是否能够改善高糖诱导的内皮功能障碍；通过测定AMPK和eNOS磷酸化水平探索非诺贝特改善内皮细胞功能障碍的可能机制。研究方法：1.动物实验雄性C57小鼠,4周龄,随机分为三组：对照组(Control)、糖尿病模型组(Streptozotocin, STZ)、非诺贝特治疗组(STZ+FF),模型组和非诺贝特治疗组小鼠连续5天腹腔注射链脲佐菌素(STZ) 60mg/kg诱导糖尿病模型。非诺贝特治疗组小鼠以100mg/kg/d的非诺贝特剂量连续灌胃2周。各组小鼠采用甘油三脂(Triglyceride, TG)试剂盒和高密度脂蛋白胆固醇(High-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)试剂盒测定TG和HDL-C的含量。治疗结束后处死动物,分离各组小鼠主动脉,利用Organ bath血管张力系统检测各组小鼠离体主动脉对乙酰胆碱(Acetylcholine, ACh)的内皮依赖性血管舒张功能(Endothelium-dependent relaxation, EDR)、对硝普钠(Sodium nitroprusside, SNP)的非内皮依赖性血管舒张功能(Endothelium-independent relaxation),对去氧肾上腺素(Phenhylephrine,Phe)的血管收缩功能(Contractile responses);利用二氢乙锭(Dihydroethidium,DHE)染色检测小鼠主动脉超氧阴离子(Superoxide onion, O2-)水平；利用Western blotting检测各组小鼠主动脉中eNOS和p-eNOS的表达水平。2.细胞实验利用免疫荧光技术鉴定小鼠主动脉内皮细胞(Mouse aortic endothelial cells, MAECs),将鉴定后的细胞分为三组：对照组(5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖模型组(33mmol/L葡萄糖)、非诺贝特处理组(5 μM非诺贝特+33mmol/L葡萄糖)。将各组细胞置于95%02和5%CO2、37℃孵箱孵育24 h后,用vitronectin测定细胞粘附能力,用matrigel胶测定细胞小管生成能力,用DAF-FM(3-Amino,4-aminomethyl-2’, 7-difluorescein, diacetate)染色检测细胞中NO水平,用DHE染色检测细胞O2-水平,利用Western blotting检测细胞中eNOS、p-eNOS以及AMPK、p-AMPK的表达水平。研究结果：1.非诺贝特能够改善STZ糖尿病小鼠血管内皮功能障碍1)非诺贝特降低糖尿病小鼠血清TG含量与对照组相比,糖尿病模型组小鼠血清TG含量明显升高；与模型组比较,非诺贝特治疗后糖尿病小鼠血清TG含量明显降低。2)非诺贝特升高糖尿病小鼠血清HDL-C含量与对照组相比,糖尿病模型组小鼠血清HDL-C含量无明显变化；与模型组比较,非诺贝特治疗后糖尿病小鼠血清HDL-C含量明显升高。3)非诺贝特改善糖尿病小鼠主动脉内皮依赖性舒张功能与对照组相比,糖尿病小鼠主动脉内皮对ACh依赖的舒张功能显著降低；非诺贝特治疗后能够显著改善糖尿病小鼠主动脉内皮依赖性舒张功能障碍。非诺贝特对糖尿病小鼠主动脉收缩功能无明显影响；L-NAME消除非诺贝特对小鼠主动脉内皮依赖性舒张功能的改善作用；非诺贝特对糖尿病小鼠主动脉非内皮依赖性舒张功能无明显影响。这些结果提示：非诺贝特能够改善糖尿病小鼠主动脉内皮依赖性舒张功能。4)非诺贝特降低糖尿病小鼠主动脉O2-水平与对照组相比,糖尿病模型组小鼠主动脉中O2-水平明显上升,而非诺贝特治疗组小鼠主动脉O2-水平显著降低。5)非诺贝特对糖尿病小鼠主动脉eNOS表达无明显影响6)蛋白检测结果表明：;NOS和p-eNOS在对照组、糖尿病模型组,以及非诺贝特治疗组的糖尿病小鼠主动脉中的表达并无显著差异。2.非诺贝特能够改善高糖诱导的MAECs功能障碍1)MAECs的鉴定用免疫荧光方法鉴定MAECs,血管性血友病因子(von Willebrand factor, vWF) /Hoechst 33258双染阳性的细胞占细胞总数的82%。2)非诺贝特减轻高糖诱导的MAECs粘附功能损伤与对照组相比,高糖处理组的MAECs粘附能力明显降低；非诺贝特处理后MAECs粘附能力显著提高。3)非诺贝特改善高糖诱导的MAECs小管形成功能障碍与对照组相比,高糖处理组的MAECs小管形成能力明显降低；非诺贝特处理后MAECs小管形成能力显著提高。4)非诺贝特阻止高糖诱导的MAECs内NO表达下降与对照组相比,高糖处理组的MAECs内NO水平明显降低；非诺贝特处理后细胞内NO水平显著提高。5)非诺贝特抑制高糖诱导的MAECs内O2-表达与对照组相比,高糖处理组的MAECs内O2-水平明显上升；非诺贝特处理后细胞内O2-水平显著降低。6)非诺贝特促进高糖诱导的MAECs内eNOS和AMPK磷酸化激活与对照组相比,高糖处理组的MAECs内p-eNOS和p-AMPK表达明显降低；非诺贝特处理后细胞内p-eNOS和p-AMPK表达显著增加。结论：非诺贝特能够改善糖尿病小鼠主动脉内皮依赖性舒张功能,改善高糖诱导的MAECs功能障碍,机制涉及AMPK/eNOS通路。