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背景:细胞周期是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为间期和分裂期两个阶段。细胞周期是细胞生命活动的重要组成部分，细胞的增殖、分化、衰老和凋亡也都是细胞周期依赖性的。研究发现，细胞周期亢进和细胞凋亡通路受损可共同导致细胞的癌变和肿瘤的发生，因此，肿瘤也被认为是一种细胞周期疾病，是当今严重威胁人类健康的重大恶性疾病之一。因此，研制针对细胞周期的具有靶向性的抗癌药物一直是近几十年来的研究热点。癌细胞的主要特点包括细胞凋亡通路调节机制的失控和细胞的异常迁移。研究表明，哺乳动物细胞周期依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs)参与调控细胞周期每个环节的起始和进程，是细胞周期调控的核心。CDK2是目前已经发现的CDKs家族成员中研究较为深入的周期调控因子之一，它与细胞周期蛋白E(cyclin E)和A(cyclin A)相互作用从而导致细胞从G1期进入S期[1]。研究显示，在肿瘤细胞中发现CDK2的表达异常增多，这也是肿瘤细胞重要的生物学特征之一。因此，CDK2已经成为治疗癌症的重要靶标。随着对CDK2晶体结构不断的研究认识，近年来已陆续报道了越来越多的ATP竞争性CDK2小分子抑制剂，已有多种有效药物获批进入临床研究阶段，但这些ATP竞争性小分子抑制剂的开发应用却面临着选择性差的巨大难题[2]。别构调节则是指某种不直接涉及蛋白质活性的物质，通过与蛋白质活性位点以外的其他位点（别构位点）相结合，从而引起蛋白质分子的构象变化并引起蛋白质活性改变的现象。别构调节剂的作用方式与传统药物（靶向于正性结合位点）相比具有许多明显的优势[3-9]:(1)对靶标呈现更高的选择性;(2)较少的不良反应;(3)低毒性等。因此，以别构调节剂为研究方向进行定向筛选和结构改造，有望为相关疾病的治疗另辟蹊径。 目的:根据p-CDK2-cyclin A3的晶体结构(PDB code:2CCI)，在CDK2与cyclin A3相互作用界面附近的口袋处，拟筛选出CDK2新型非肽类别构抑制剂的先导结构。 方法:本论文以p-CDK2-cyclin A3的晶体结构(PDB code:2CCI)为靶标，综合运用分子对接、虚拟筛选的方法，结合体外生物活性测试，并进行了对接模型验证和非竞争性验证，同时应用GST pull-down技术初步探讨了小分子的别构作用机制。 结果:(1)初筛获得了I4和I9两个化合物具有较强的p-CDK2-cyclin A3抑制活性，I4和I9对p-CDK2-cyclin A3的IC50值分别为13.59μM，52.12μM;(2)在不同ATP和底物浓度下，I4和I9对p-CDK2-cyclin A3的IC50值并未有显著改变，仍然具有明显的p-CDK2-cyclin A3抑制活性;(3)I4对p-R150A-cyclin A3的IC50值为330.2μM，对p-Y180A-cyclin A3的IC50值为316.1μM，是野生型的23-24倍，抑制活性明显降低;I9对p-R150A-cyclin A3的IC50值为884.7μM，对p-Y180A-cyclin A3的IC50值为151.4μM，抑制活性同样明显降低;(4)I4和I9均可抑制人源肺癌细胞A549、肝癌细胞HepG2和乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖，I4对A549、HepG2和MDA-MB-231的IC50值分别为49.04μM，36.44μM，43.27μM，I9对A549、 HepG2和MDA-MB-231的IC50值分别为85.24μM，299.7μM，460.4μM;(5)100μM时，I4有效地阻滞HepG2细胞周期在S期，S期细胞的百分含量从对照组的17.67％增加到药物作用组(100μM)的28.25％，当I4的作用浓度增加到200μM时，进入G2期的HepG2细胞呈现出减少的趋势;I9在低浓度下(10-50μM)微弱地阻滞A549细胞周期在S期，当I9的作用浓度增加到200μM时，则有效地阻滞A549细胞周期在S期，S期细胞的百分含量从对照组的11.53％增加到的41.30％;(6)GST-CDK2能够与His-cyclin A3在体外特异性结合，加入I4和I9，His-cyclin A3条带明显减弱，且小分子浓度越高，His-cyclin A3条带减弱的程度越明显。目前结果显示，还需要对I4和I9做进一步的结构优化以提高它们的活性。这些研究结果为靶向作用于CDK2的别构治疗药物的开发奠定了基础。 结论:(1)综合利用分子对接、虚拟筛选结构分析以及生物活性测试筛选出具有明显的p-CDK2-cyclin A3抑制活性的先导化合物I4和I9，I4和I9对p-CDK2-cyclin A3的IC50值分别为13.59μM和52.12μM;(2)通过改变ATP和底物肽的浓度初步证实了I4和I9是非竞争性抑制剂;(3)根据对接模型和定点突变技术初步验证了I4和I9靶向作用于CDK2底物位点以外的CDK2-cyclin A3相互作用界面附近的口袋，此口袋由Arg126，Arg150，Arg169和Tyr180等氨基酸残基组成;(4)I4和I9对人源肿瘤细胞具有广谱的生长抑制和细胞毒效应，两个化合物可抑制人源肺癌细胞A549、肝癌细胞HepG2和乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖，I4的抑制效果更强;(5)I4和I9可分别诱导HepG2和A549细胞周期阻滞在S期;(6)I4和I9均可有效阻断CDK2-cyclin A3复合物的相互作用，通过抑制CDK2-cyclin A3复合物的形成进而发挥别构抑制作用。