论文部分内容阅读
内分泌干扰物质(endocrine disrupting chemicals， EDC)，是指干扰生物体正常的内分泌机能，并影响生物体或其后代发育、繁殖和行为的外源性化学物质，由于它往往具有类雌激素作用，故又称为环境雌激素(ecoestrogen)。壬基酚(Nonylphenol，NP)和双酚A(Bisphenol A，BPA)是两种典型的环境雌激素，研究报道，NP和BPA对于生物体内分泌的干扰主要表现为雄性雌性化，而且可以通过食物链在各级生物体内转移和长期积累，最终干扰生物体的正常内分泌功能。
关于各种NP和BPA的研究尚处于起步阶段，研究对象也大多集中在脊椎动物中，如大鼠、两栖类、鱼类等。对于甲壳类的EDC研究少有报道。生活在水环境中的甲壳动物极易受到：EDC的作用，影响着生态稳定和人类生存安全，开展这方面研究无疑有着重要意义。
本研究以具有较高经济价值的罗氏沼虾为研究对象，运用RT—PCR和透射电镜等实验方法，在个体和细胞水平展开了急性毒性实验研究(半致死浓度，LC<,50>)、细胞超微结构损伤观察(病理变化)、并在分子水平以VTG为生物标志物对三种典型的环境雌激素壬基酚、双酚A和雌二醇对雌、雄罗氏沼虾的雌激素效应分别进行了研究。实验结果表明，在一定浓度范围内NP能够对罗氏沼虾产生细胞毒性和雌激素效应。
1．NP对罗氏沼虾的急性毒性研究
研究注射了溶剂对照组、500 mg/kg、625 mg/kg、750 mg/kg、875 mg/kg和1000 mg/kgNP后，96h内NP对罗氏沼虾的毒性效应、中毒特征、半致死浓度并计算出安全浓度。旨在探索NP对水生生态系统和人类健康的潜在影响，并为后续的细胞超微结构损伤和VTG基因表达干扰的实验研究提供安全浓度参考依据。
结果得到：罗氏沼虾对NP的敏感度随NP浓度升高而增大，48 h后1000 mg/kg组试验虾死亡率为100％；溶剂对照组和对照组各个时间点存活率均为100％。利用Reed-MLlench法计算24 h、48 h、72 h和96 h的半致死浓度分别为937.5、812.5、625和583.3 mg/kg，安全浓度为183.1 mg/kg。
2.NP对罗氏沼虾肌肉和肝胰腺损伤的研究
在50 mg/kg，100 mg/kg，150 mg/kgNP三个浓度下，观察96h后细胞的损伤。
肝胰腺细胞对照组：胞质中内质网较丰富，线粒体丰富，内嵴发达，细胞核形状规则，微绒毛排列整齐；50mg/kg组：内质网增生，部分空泡化，线粒体丰富，细胞核边际不清晰，部分溶解，微绒毛排列整齐；100mg/kg组：细胞内质网非常丰富，部分空泡化，粗面内质网膜上的核糖体脱落，有大体积的线粒体出现，内嵴清楚，细胞核边际部分扩张，微绒毛排列整齐，部分缺少；150mg/kg组：细胞内质网部分扩张，囊泡化，线粒体丰富，且内嵴模糊，部分空泡化，细胞核边际部分扩张，微绒毛排列整齐；
肌细胞对照组：肌浆网丰富，线粒体丰富，肌浆网与T小管形成三联体(Trlad)，肌原纤维明带暗带清晰可辨；50mg/kg组：肌浆网丰富，水肿，细胞核膜轻微水肿，肌原纤维明暗带模糊不可辨；100mg/kg组：核膜部分溶解，肌丝不清晰，肌膜部分溶解，线粒体内嵴溶解，空泡化，肌丝扭曲、断裂，间隔变大，肌浆网水肿，产生空白区；150mg/kg组：肌原纤维萎缩扭曲，线粒体内嵴溶解，肌膜溶解，核膜溶解，胞质中出现空白区。
结果表明，NP对罗氏沼虾的毒性具有组织特异性，在相同浓度下，肌细胞的损伤严重，而肝细胞损伤轻微。
3.壬基酚和双酚A对雄性罗氏沼虾VTG基因表达的影响
采取雄性罗氏沼虾亲虾，肌肉注射NP和BPA。给药浓度均为0、溶剂对照组、50、100、150 mg/kg进行NP和BPA对肝胰腺VTG基因表达影响的剂量效应实验，并对150 mg/kgNP和100mg/kgBPA进行12天的时间效应实验。
剂量效应实验结果表明，NP和BPA均具有雌激素效应，且NP的雌激素效应大于BPA的雌激素效应。三个剂量的NP对VTG的诱导都明显高于对照组，150mg/kgNP对VTG表达水平的诱导最高，NP对VTG的诱导表现出剂量依赖效应的趋势；三个剂量的BPA对VTG水平都明显高于对照组，100mg/kgBPA对VTG的诱导效应最大，50mg/kgBPA与150mg/kgBPA对VTG的诱导效应相似，BPA对VTG的诱导没有表现明显的剂量一依赖效应。50mg/kgBPA的效应与50mg/kgNP效应接近。
时间效应实验证明，NP和BPA对受试虾的VTG表达水平有持续性诱导。150mg/kgNP作用下，各个时间点VTG表达水平都高于对照组。第四天VTG表达水平达到第一个峰值，之后有下降趋势，到第八天达到第二个峰值，但低于第一个峰值，之后直到第12天，VTG表达水平呈下降趋势，且都高于对照组VTG水平；在100mg/kgBPA作用下，各个时间点VTG表达水平均高于对照组，且除第7天与150mg/kgNP的诱导效应接近外，其余各时间点VTG表达水平均低于150mg/kgNP的诱导效应。100mg/kgBPA作用下，VTG表达水平在第4天出现第一个峰值，之后呈下降趋势，第7天出现第二个峰值，且略高于第一个峰值，之后又呈下降趋势，第12天VTG表达水平略有上升。
这与NP和BPA对很多脊椎动物的雌激素效应研究结果相类似，也说明了跟很多脊椎动物一样，VTG可以作为罗氏沼虾EDC研究的一个生物标志物。
4.壬基酚和雌二醇干扰罗氏沼虾卵黄蛋白原VTG基因表达的效应
采取孵化后雌性亲虾，NP和E<,2>浸泡处理，给药浓度分别为：NP Ⅰ 100 μg/L和NP Ⅱ 0.01 μg/L；E<,2>Ⅰ l μg/L和E<,2>Ⅱ 0.01 u g/L，于第3 d和第5 d取虾卵巢和肝胰腺，对VTG基因表达水平进行半定量分析。
结果表明，肝胰腺中，NP Ⅰ(100 μg/L)处理后，3 d内VTG表达量上升，处理5 d后VTG表达量与对照组比较差异不明显；NP Ⅱ(0.01μ g/L)处理后，VTG表达量无明显变化；E<,2>Ⅰ(1 μg/L)处理后， VTG基因表达在3 d和5 d内与对照组比较，表达量明显上升；E<,2>Ⅱ(0.01 μg/L)处理后，3 d内VTG表达量上升，但明显低于E<,2>Ⅰ(1μg/L)3 d和5 d诱导效应，E<,2>Ⅱ(0.01 μg/L)处理5 d后VTG表达量有下降，但仍高于对照组表达量。
卵巢中，经NP Ⅰ(100μg/L)处理后，3 d和5 d内VTG表达均上升且水平差异不大；经NP Ⅱ(0.01μg/L)处理后，3 d后表达量上升，5 d后回落，略高于对照组水平；经E<,2>Ⅰ(1μg/L)处理后，卵巢中VTG基因表达在3 d和5 d内与对照组比较，均有明显上升，5 d后的表达量比3 d后的表达量有所降低；经E<,2>Ⅱ(0.01μg/L)处理后，3 d内卵巢中VTG表达比对照组表达量高，5 d后表达量有下降，略高于对照组。
罗氏沼虾表现出对NP浓度有一定的剂量依赖关系，且1 μg/L和0.01 μg/L E<,2>均表现了较强的雌激素效应，雌激素活性E<,2>>NP。这可能由于E<,2>是一些甲壳动物本身存在的雌激素所造成，所以本实验也从另一个方面证明了E<,2>在干扰罗氏沼虾生殖过程中的可能有与脊椎动物类似的作用途径。