FGF10和Spry4基因的克隆及其在绵羊皮肤中的表达

• 作 者: 袁枫
• 机 构: 新疆农业大学
• 出 处: 新疆农业大学
• 发表日期: 2015年期
• 关键词: 中国美利奴羊 毛囊 FGF10 Spry4 免疫组化 RT-PCR 克隆

本文以中国美利奴羊妊娠55、75、85、105和135天胎羊皮肤为研究对象。首先对FGF10和Spry4基因的CDS区进行克隆及真核表达;紧接着采用荧光定量PCR的方法,探究上述四个时期时FGF10和Spry4基因的转录规律;随后利用石蜡切片HE染色方法,观察胎羊体侧皮肤的毛囊在不同时期的发育情况;最后通过免疫组织化学对FGF10和Spry4两种蛋白在毛囊发育过程中的表达进行定位,从而探讨FGF10和Spry4在毛囊发育调控中的作用。通过上述研究方法,得到的结论如下:1.以美利奴羊皮肤组织的RNA为模板反转录获得cDNA,再利用PCR技术扩增获得Spry4和FGF10基因全长编码区,克隆到zero-PCR@TM-Blunt载体进行测序。随后将ToPo-Spry4和ToPo-FGF10分别亚克隆到pcDNA3.0真核表达载体,经脂质体转染293T细胞中表达,Western blot鉴定表达产物。进一步对Spry4及FGF10核酸和氨基酸序列进行分析。首次克隆获得绵羊Spry4基因编码序列(GenBank登录号:KP280032)。SDS-PAGE结果显示,Spry4重组表达的蛋白大小为36 kDa,FGF10重组表达的蛋白大小为24 kDa,均与预期蛋白大小一致。2.中国美利奴羊的毛囊发育过程中,FGF10和Spry4在五个时期的表达存着在较大的差异。FGF10基因从娠55天到75天时有所降低,当到达85天时表达量成倍增高从而到达峰值,从85天到105天时表达量迅速下降至与55天表达量相当。到135天的时候表达量稍有增长。Spry4基因的表达量在妊娠55天表时最高,随后保持下降趋势,直到85天时降至较低的水平,到105天时迅速上升,上升至几乎与55天时相等的表达量。到妊娠135天表达量降至最低。3.在75天时,初级毛囊原始体形成。FGF10和Spry4在表皮层和初级毛囊原体始处均有表达。85天初级毛囊继续向真皮方向生长,周围有次级毛囊原始体形成。此时FGF10主要表达于表皮层和次级毛囊原始体。而Spry4在表皮层、初级毛囊和次级毛囊原始体均有表达。当胚胎发育到妊娠105天时,FGF10的组化染色明显变浅,与定量呈现相同趋势。其主要在表皮层表达。与此同时,Spry4有着很广范的表达部位。在表皮层、初级和次级毛囊内均有表达。胚胎发育到135天时,初级毛囊和次级毛囊基本发育完全,FGF10和Spry4的表达部位一致,在表皮层和毛囊的内根鞘和外根鞘处有表达。在出生后8周时FGF10和Spry4的表达部位几乎与妊娠期第135天时相同。