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目的：检测靶向DJ-1基因短发夹环状小干扰RNA(short hairpin RNA, shRNA)表达质粒对子宫内膜癌Ishikawa细胞DJ-1基因的沉默作用并探讨其对细胞增殖及凋亡的影响。方法：1.设计合成3条靶向DJ-1的shRNA,克隆到质粒pGPU6/GFP/Neo中构建重组载体质粒,并对重组载体质粒进行酶切和测序鉴定。将重组载体质粒转染到Ishikawa细胞,利用real-time PCR和western blot技术检测干扰质粒的沉默效果并筛选出抑制效率最高的重组表达载体质粒。实验分组：①RNAi1组：pGPU6/GFP/neo-DJ-1-shRNA1转染Ishikawa细胞；②RNAi2组：pGPU6/GFP/ne-o-DJ-1-shRNA2转染Ishikawa细胞;③RNAi3组：pGPU6/GFP/neo-DJ-1-shRNA 3转染Ishikawa细胞；④阴性对照组：转染与目的基因无关干扰质粒的Ishikawa细胞；⑤细胞对照组：仅用细胞培养液培养的Ishikawa组。2. pGPU6/GFP/neo-DJ-1-shRNA1转染入Ishikawa细胞后,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测其抑制Ishikawa细胞增殖作用。pGPU6/GFP/neo-DJ-1-sh-RNA1浓度分别为2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL和20μg/mL作用于Ishikawa细胞24h、48h、72h和96h。3. pGPU6/GFP/neo-DJ-1-shRNA1 (20 μg/mL)转染入Ishikawa细胞72 h后采用流式细胞术,探讨pGPU6/GFP/neo-DJ-1-sh-RNA 1对子宫内膜癌Ishikawa细胞增生及凋亡的影响。实验分组：①转染组：pGPU6/GFP/neo-DJ-1-shRNA1转染Ishikawa细胞；②空载质粒对照组:pGPU6/GFP/neo质粒转染Ishikawa细胞；③阴性对照组：转染与目的基因无关干扰质粒的Ishikawa组；④脂质体对照组：仅添加转染试剂的Ishikawa组；⑤细胞对照组：仅用细胞培养液培养的Ishikawa组。结果：1.经测序鉴定确认后,靶向DJ-1的3个重组载体质粒构建成功,分别命名为pGPU6/GFP/Neo-DJ-1-shRNA 1, pGPU6/GFP/N-eo-DJ-1-shRNA 2, pGPU6/G-FP/Neo-DJ-1-shRNA 3。2. Real time-PCR技术检测pGPU6/GFP/neo-DJ-1-shRNA转染Ishikawa细胞72 h后DJ-1 mRNA表达水平。结果显示RNAi1组、RNAi2组、RNAi3组均显著低于细胞对照组,差异均有统计学意义(P均<0.01)；细胞对照组与阴性对照组间相比差异无统计学意义。结果表明转入pGPU6/GFP/neo-D J-1-shRNA后,部分抑制了DJ-1 mRNA的表达,同时RNA 1组的沉默效率最好。3. Western blot技术检钡I pGPU6/GFP/neo-DJ-1-shRNA转染Ishikawa细胞72h后DJ-1蛋白表达水平。结果显示RNAi1组、RNAi 2组、RNAi 3组均显著低于细胞对照组,差异均有统计学意义(P均<0.01)；细胞对照组与阴性对照组间相比差异无统计学意义。结果表明转入pGPU6/GFP/neo-DJ-1-shRNA后,部分抑制了DJ-1蛋白的表达,同时RNA 1组的效率最好。4. pGPU6/GFP/neo-DJ-1-shRNA1浓度(μg/mL)分别为2.5、5、10和20时作用于Ishikawa细胞24h、48h、72h和96h后,其细胞抑制率(%)分别为：22.80±0.75、37.50±1.15、43.75±2.74、53.25±4.46;28.20±1.32、43.15±2.06、49.15±4.15、66.57±2.08；39.70±1.43、52.75±3.53、55.05±3.22、75.65±3.42；42.35±1.24、54.00±4.17、65.55±2.63、89.50±4.43；结果表明DJ-1干扰质粒对Ishikawa细胞增殖抑制作用随着pGPU6/GFP/neo-DJ-1-shRNA1作用浓度和作用时间的增加而增加。5. Annexin V/PI双染流式细胞术检测pGPU6/GFP/neo-DJ-1-shRNA 1作用Ishikawa细72h后Ishikawa细胞凋亡率的改变,结果显示pGPU6/GFP/neo-DJ-1-shRNA组早期细胞凋亡率(86.48±7.25)%明显高于细胞对照组(0.09±0.08)%、空载质粒对照组(0.11±0.08)%、阴性对照组(0.48±0.05)%和脂质体对照组(5.23±1.22)%; pGPU6/GFP/neo-DJ-1坏死细胞和晚期细胞凋亡率(12.02±1.2)%同样明显高于细胞对照组(0.03±0.02)%、空载质粒对照组(0.00±0.01)%、阴性对照组(0.45±0.06)%和脂质体对照组(4.96±1.02)%,差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论：沉默DJ-1可抑制子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖,促进其凋亡。