论文部分内容阅读
1、背景细胞间粘附分子-1（ICAM-1,CD54）属免疫球蛋白基因超家族,它通过介导细胞与细胞间,细胞与细胞外基质间的粘附作用,参与一系列生理及病理过程。ICAM-1为单链跨膜糖蛋白,分子量80-110KDa,由5个Ig样结构域的胞外区、疏水跨膜区和胞质短尾组成。人ICAM-1基因DNA包含7个外显子、6个内含子、一个上游调控区、一个3p非编码区,调控区内有IFN反应元件、糖皮质激素受体结合位点、核转录因子-κB（NF-κB）结合位点、活化剂蛋白-1（AP-1）反应元件等,信号传导与转录活化因子（STAT）、NF-κB、转录调节因子（Ets）等转录因子可分别与这些元件结合而影响该基因的转录。其中NF-κB在激活启动中起主要作用,NF-κB通过特异性的蛋白-蛋白的相互作用,同其他转录因子和共激活因子一起参与ICAM-1的表达调节。目前发现的ICAM-1的受体有两个,淋巴细胞功能相关抗原-I（LFA-1）和β2-整合素amb2（Mac-1）,均属整合素家族。静息状态下ICAM与LFA-1的亲和力很低,为105-106M左右。静息的亲和力在调节LFA-1后可增高:一是整合素在膜上的分布,增加了聚集的程度可使亲和力增加;另是整合素构型的改变,使与其配体连接的内在亲和力增高。ICAM-1分布广泛,在大多数组织,ICAM-1的表达是低水平的。生理情况下,这种低水平表达为细胞识别、激活、增殖、分化、运动提供了潜在的分子基础,帮助机体建立稳定的内环境。此外,ICAM-1在病理情况下也充当了重要的角色,尤其是炎症反应。ICAM-1可受许多因素的诱导而上调,如细胞因子（IL-1,IL-2,IL-6和TNF-α等）,其他炎症介质如血小板激活因子（PAF）等,均可使ICAM-1增多。因此,对ICAM-1广泛而客观的研究是极其必要的。有研究认为白细胞从体循环迁移至炎症部位包含一系列过程:在炎症时,内皮细胞表面的选择素（E选择素和P选择素）和粘蛋白（可与L选择素结合）表达快速增加,而选择素和糖类的结合又可介导白细胞“聚合（tethering）和滚动（rolling）”,使循环中快速移动的白细胞变慢并与内皮细胞松散结合;接着内皮或间质释放趋化因子而导致白细胞表面的整合素（如LFA-1和Mac-1）亲和力增加。这些整合素与其在受刺激的内皮细胞上的配体（ICAM-1,ICAM-2和VCAM-1）结合后,可导致白细胞被捕获和粘附在内皮细胞表面。最后,由于白细胞表面的整合素和细胞外基质蛋白相互作用,而使粘附反应扩大,并促使白细胞穿越内皮到达炎症部位。而根据我们文献学习中发现,ICAM-1既在细胞粘附中起着重要作用,在白细胞的跨内皮移行中亦不可缺少。2、目的牙髓被周围硬组织包围,仅通过根尖孔和副根尖孔与周围组织联系,形成一种相对独立的组织架构。同时也形成了其独特的生理特点:也就是牙髓对任何的伤害或刺激均以牙髓的炎症来反应。这是其基本的生物防御机制。而在临床上,牙髓也可以因为牙体硬组织龋病或牙周炎症而长期暴露于炎症刺激之下,而我们应对的诊断和治疗方式是较为单一的。这就需要我们对牙髓的炎症过程和机理进行深入的研究。相对应其他组织及疾病中ICAM-1较为广泛的关注以及相对明确的运作机理研究,在牙髓中ICAM-1的研究是较为局限的。因此我们采用机械暴露大鼠牙髓并旷置口腔,通过口腔菌群的自然感染来诱导牙髓炎,在此模型基础上,通过免疫组化及图像分析技术观察实验性牙髓炎发生、发展中ICAM-1的表达,初步探讨ICAM-1在实验性牙髓炎发生、发展全过程中的作用。3、材料与方法3.1分组及建立大鼠实验性牙髓炎模型SD大鼠60只随机分为6组,每组10只。A组对照组:不做任何处理;实验组:根据处理时间,B组牙髓炎1小时、C组牙髓炎1天、D组牙髓炎3天、E组牙髓炎5天、F组牙髓炎7天。实验组大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉后用005号小球钻将右侧上颌第一、第二磨牙牙合面开髓,深度能探及一细小的穿髓点,将髓腔直接暴露于口腔环境中。3.2标本制备按上述分组分别处死动物,取右侧上颌磨牙固定,常规脱钙,常规脱水、石蜡包埋,沿牙齿颊舌向过窝洞自冠部到根尖部作厚度约为5μm的连续切片。3.3组织学观察HE染色后光镜下观察,检验组织形态学变化。3.4免疫组化染色SP法:石蜡切片37℃烘片过夜,脱蜡,蒸馏水冲洗。3%H2O2,室温湿盒10分钟阻断内源性氧化物酶,蒸馏水冲洗,PBS冲洗3次。微波抗原修复,滴加10%非免疫血清,室温湿盒15分钟,吸干,勿洗。滴加ICAM-1单抗,4℃冰箱湿盒过夜,PBS冲洗3次。滴加生物素标记的二抗,37℃湿盒15分钟PBS冲洗3次,滴加链霉素抗生素蛋白-氧化物酶,37℃湿盒10分钟PBS冲洗3次。DAB显色剂显色,流水冲洗,复染,脱水透明,封片。实验中用PBS代替一抗作阴性对照。3.5 ICAM-1表达的测量选取同一染色条件的不同位点切片,应用日本Olympus光学显微镜,日本JVC ky-F30B 3-CCD彩色图像摄录输入仪,美国MediaCybernetics公司Image ProPluss 5.0图像分析系统。每只动物选取四张切片,每张切片上选择三个视野,高倍镜下（×40）摄片,测量照片中的面积、累积光密度值和平均光密度值,并取均数作为每只动物的平均光密度值（0D）。3.6统计学处理实验数据均以（?）±s表示,采用SPSS 13.0软件分析。多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）,组间两两比较采用最小差异（least significantdifference,LSD）t检验,以P＜0.05为有显著性差异。4、结果4.1组织学变化正常大鼠牙髓:牙髓组织内有少量血管和大量分布的成纤维细胞,在牙髓和牙本质交界处的髓腔内侧有一层柱状排列的成牙本质细胞。实验组大鼠均出现了典型的牙髓炎表现。牙髓炎症可在1小时组出现,并随时间发展逐渐加重。中性粒细胞出现较早,逐渐增多;淋巴细胞在牙髓炎第三天开始出现,5至7天逐渐增多。血管增生和扩张、充血也是牙髓炎症的主要表现。4.2免疫组化染色结果对照组正常大鼠牙髓组织中:ICAM-1在血管内皮细胞中为弱阳性表达。大鼠牙髓炎症1小时组:ICAM-1在血管内皮细胞中为阳性表达。大鼠牙髓炎1天组:ICAM-1在血管内皮细胞中为强阳性表达,在炎性细胞中也有强阳性染色,故牙髓血管呈环行着色。大鼠牙髓炎3天组:ICAM-1免疫染色与牙髓炎1天组相接近。大鼠牙髓炎5天组:上述阳性ICAM-1染色程度开始下降,但血管内皮细胞染色仍呈强阳性。大鼠牙髓炎7天组:上述ICAM-1阳性染色程度进一步下降,但比正常大鼠牙髓组织染色略强。4.3图象及统计分析采用单因素方差对多组间比较发现各组之间有差异:F=10.692,P＜0.001。采用LSD法进行组间两两比较发现:对照组（A）ICAM-1光密度值与牙髓炎各组比均较有差异;牙髓炎1小时组（B）与牙髓炎1天组（C）、牙髓炎3天组（D）、牙髓炎5天组（E）有差异;牙髓炎7天组（F）与牙髓炎1天、3天、5天组有差异,与牙髓炎1小时组未见差异。5、结论牙髓暴露法可以成功建立牙髓炎模型,通过此模型可以动态的观察牙髓炎症的完整过程,对正常牙髓、急性炎症牙髓、慢性炎症牙髓做出对比。本实验发现在正常大鼠牙髓血管内皮细胞ICAM-1有弱阳性表达。在大鼠牙髓炎发生后1小时ICAM-1表达上调即已出现,虽然表达较低,但仍表明牙髓炎症初始ICAM-1即参与其中。随着时间发展ICAM-1表达增强,1天既已达到高峰,3至5天维持较高水平,7天时降至牙髓炎初始时水平。本实验虽未对白细胞进行客观的计量,但通过常规的病理知识结合本实验的组织学观察,可以明确中性粒细胞在急性炎症期牙髓中明显增多,慢性炎症期（7天组）逐渐减少,这与ICAM-1的表达结果相对应,提示了ICAM-1在牙髓炎中促使中性粒细胞粘附和跨内皮移行的作用。但是,在本实验中淋巴细胞和ICAM-1的表达并不同步,当淋巴细胞逐渐增多时（5天组到7天组）,ICAM-1的表达却呈现下降趋势,这表明牙髓炎中ICAM-1对淋巴细胞的粘附和跨皮移行作用并不显著。还应该有其他的淋巴细胞介导方式。在牙髓炎的研究中,尽管有学者研究了在人正常牙髓、慢性牙髓炎和急性牙髓炎牙髓组织中ICAM-1的表达,但我们在动物实验模型上的实验目的是:在细胞分子水平上动态的观察牙髓炎症发生、发展的全过程,进一步明确ICAM-1在参与牙髓炎发生、发展过程中的作用机理。